嗜热微生物中获取耐乙醛变性醛缩酶

李铖璐,杜鹏飞,裴晓林,吴慧丽,谢开林,王秋岩

(杭州师范大学 生物医药与健康研究中心，浙江 杭州 310012)

0 前 言

2-脱氧-D-核糖-5磷酸醛缩酶(2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase, DERA, EC 4.1.2.4)是一种特殊的裂解酶，参与多种微生物的DNA代谢路径，可以催化其天然底物乙醛和D-甘油醛-3-磷酸可逆的醛缩反应形成D-2-脱氧-5-磷酸.这种酶可以在醛缩底物上引入多个手性中心，这个特点使它成为合成多种稀有糖和糖衍生物的有力工具[1].Wong和其同事在1994年报道了“醛缩酶催化三分子乙醛的不对称醛缩反应”.这个反应能够在其合成产物中形成新的碳碳键并且可以引入最多两个手性中心，其内酯产物可以被用作重要的他汀中间体使用(见反应式1[2]).今天，作为降血脂的3-hydroxy3-methylglutary (HMG)-CoA还原酶抑制剂的他汀类药物是世界上最为畅销的全合成药物，年销售额可以达到上百亿美元[3].这里值得一提的是醛缩反应是一个平衡的过程，四碳的中间产物形成是可逆的，在这个中间产物与另一分子乙醛第二次醛缩时，因为最后形成了环化内酯，这会驱动反应平衡不断向最终产物进行.这个反应具备的主要优点是，可以用价格低廉的乙醛作为原料，一步形成具有两个手性中心的六碳中间体.因为这个酶催化路径如此的有吸引力，人们为了开发出更为高效的醛缩酶付出了很多努力.到目前为止，研究者已经纯化和表征了来源于E.coliK12,Klebsiellapneumoniae,Lactobacillusplantarum,Salmonellatyphimurium,StreptococcusmutansGS-5,Yersiniasp.EA015,Aeropyrumpernix,Pyrobaculumaerophilum和Thermotogamaritime的DERA[2,4-11].另有报道采用理性设计，设计了一个带有S238D突变的醛缩酶突变体，这个突变体可以接纳新的醛类分子作为它的底物，可以方便的与后续母环进行对接，这个突变体合成阿托伐他汀侧链分子的反应比野生型更为高效[12].Greenberg和他的同事也从环境样品中发现了一个新的醛缩酶，在放大反应中，该酶对乙醛衍生物表现出比大肠杆菌醛缩酶更好的耐受性[13].Jennewein等采用定向进化技术，获得了一个与野生型相比较体现出10倍增长的氯乙醛抗性的突变体[14].依靠强大的基因工程和蛋白质工程手段，尽管人们在醛缩酶耐乙醛变性的功能改进上，已取得很大进步，但仍然需要更多的途径，尤其是更为便捷的途径获取抗乙醛变性的醛缩酶.

生物催化剂-酶的稳定性，尤其是耐有机溶剂的稳定性，在工业中特别是在精细化工和医药行业中的应用，一直是受到关注的热点问题[15-16].来源于嗜热微生物的酶具有很高的热稳定性，这种热稳性质与包括洗涤剂和有机溶剂等变性剂条件下的稳定性有正向相关性.人们已经发现了许多来源于极端古菌微生物的蛋白酶，在高温条件下，甚至同时存在高浓度洗涤剂和变性剂条件下仍然保持稳定[17-19].在混合缓冲液和水有机溶剂混合体系中，比如乙腈和二甲基亚砜中，来源于嗜热微生物A.pernix,P.calidifontis和S.tokodaii的酯酶表现出良好的稳定性[20].Hao等的工作表明，一种定向进化获得的热稳果糖二磷酸醛缩酶，同样在有机溶剂中也表现出增强了的稳定性[21].这种被证明了的热稳定性和耐有机溶剂性质的正向相关性，使得嗜热微生物来源的醛缩酶，有可能成为需要耐受高浓度乙醛底物的工业醛缩反应的良好候选者.

在该实验中，笔者克隆和过表达了Geobacillusthermodenitrificans的耐热醛缩酶，对其进行了初步的酶学性质的表征，并测量了该酶的热稳定性和耐乙醛抗性，结果表明，该酶具备良好的热稳定性，同时对高浓度乙醛的耐受能力较好.进一步的连续醛缩活力的测定表明，其连续醛缩活力远远高于来源于常温大肠杆菌的醛缩酶.

反应式1 DERA催化的连续醛缩反应Scheme 1 Sequential aldol reactions catalyzed by DERA

1 材料和方法

1.1 实验材料

pET-303/CT-His从Novagen (Madison, WI, USA)购买获得，大肠杆菌BL21-CodonPlusTM-RIL (DE3)菌株为该实验室保存.大肠杆菌DERA酶(DERAEco), 2-脱氧-D-核糖-5磷酸(2-Deoxy-D-Ribose-5-Phosphate，DRP), triose-phosphate isomerase和glycerol-3-phosphate dehydrogenase均从sigma公司购买，其它化学试剂均是分析级别.

1.2 质粒构建

来自嗜热微生物Geobacillusthermodenitrificans的醛缩酶核苷酸序列从基因数据库检索获得.其基因编码的蛋白质序列被命名为DERAGth.该全长编码序列由上海生物工程技术服务有限公司进行全基因合成.基因5端的起始密码子前引入一个唯一的XbaI限制性酶切位点，同时，3`端引入XhoI限制性酶切位点并替代终止密码子.合成的基因用XbaI和XhoI进行酶切，再与同样使用XbaI和XhoI酶切后的线性pET303/CT-His载体连接，构建重组质粒pET-DERA，重组质粒采用常规化学转化法转化BL21-CodonPlusTM-RIL (DE3).

1.3 纯化与表达

携带DERA基因的重组质粒转化大肠杆菌，转化子在1 mL LB培养基中37 ℃生长1 h后，再涂布于含氨苄霉素(100 mg/L)的LB固体平板上，37 ℃过夜培养获得单克隆.挑取单个转化子在含氨苄霉素(100 mg/mL)的100 mL LB培养基中过夜培养(37 ℃, 220 r/min).培养至光学密度达到0.6，加入0.5 mmol IPTG进行诱导表达，继续在37 ℃培养5 h.11 000 r/min离心5 min收集细胞，-80 ℃反复冻融3次后，在100 mmol phosphate, 200 mmol sodium chloride(pH7.5)缓冲液中重新悬浮，重复上离心步骤后取上清液.携带His-tag的DERA酶液使用Ni柱亲和层析纯化获得，操作按照镍柱纯化手册进行(Ni-Sepharose HP, Amersham Biosciences, Freiburg, Germany).酶液冷冻干燥获得酶粉，并在-80 ℃储存.SDS-PAGE电泳检测酶的纯化情况.Bradford法进行确定蛋白浓度.

1.4 序列分析

使用CLUSTALW软件进行多重序列比对，除该研究中的醛缩酶序列外，又选取了来源于其它嗜热微生物具有代表性的3个DERA序列，分别为来自嗜热微生物A.pernix,P.aerophilum和T.maritime.序列信息来源于UniProtKB/TrEMBL数据库，对应的Accession Numbers 如下:A.pernix, Q9Y948;P.aerophilum, Q8ZXK7;以及T.maritima, Q9X1P5.

1.5 基本酶学性质表征

DRP分解活性测定按照文献进行[11].每分钟转化1 μmol NADH的酶量定义为1个酶活单位.在不同的pH条件下进行反应，同样按照文献描述的活力测定方法进行，确定酶的最适pH.所用的缓冲液及梯度如下：sodium acetate (0.1 M, pH 3.0～pH 6.0), imidazole-HCl (0.1 M, pH 6.0～pH 7.5), triethanolamine-HCl (0.1 M, pH 7.5～pH 8.5) 和 glycine-NaOH (0.1 M, pH 8.5～pH 11.0). 最适温度在20—100 ℃区间内选取不同温度条件下进行反应，同样按照文献描述的活力测定方法进行，确定酶的最适反应温度.

1.6 热稳定性与耐乙醛稳定性

同样为0.5 mg/mL的酶在最适缓冲液中，在20—100 ℃区间内选取不同温度条件下温浴10 min，应用上述DRP分解活性方法测定残余活性.酶在自身的最适缓冲液中，同时添加乙醛至终浓度为300 mmol，在25 ℃下温浴.在一定的时间间隔后使用上述DRP分解活性测定方法测定其残余的活性.

1.7 连续醛缩活力

连续醛缩反应通过薄层色谱法对产物进行分析.50 μL的反应混合物包括100 mmol目标酶的最适缓冲液, 300 mmol乙醛和23 μg的醛缩酶.在25 ℃反应4 d后，反应通过冰上终止，离心去除蛋白.2 μL的滤液进行TLC分析.展开溶剂为1-butanol, acetic acid和H2O比例为4∶1∶1(vol/vol/vol)，反应生成物的斑点通过茴香醛试剂显色.

图1 重组蛋白SDS-PAGE电泳Fig. 1 SDS-PAGE analysis of recombinant DERAs from G. thermodenitrificans

2 结果与讨论

2.1 蛋白表达和纯化

DERAGth在大肠杆菌中实现了过量表达，全菌体电泳结果显示诱导后的蛋白量明显高于诱导前，经过镍柱纯化后，目标蛋白电泳为单一条带(图1).经镍柱纯化回收，回收效率接近40%(表1).

表1 蛋白质纯化过程回收效率

2.2 序列分析

序列多重比对结果表明：DERAGth与其它嗜热微生物来源代表性的醛缩酶相比，彼此的氨基酸序列相似度比较低.但是形成Schiff-base的基本催化残基位点Lys126，在所有比对的醛缩酶中是完全保守的.活性位点Asp91和Lys154，因在质子的传递系统中起着重要作用，在所有比对序列中也是保守的(图2).

图2 蛋白质序列比对Fig. 2 Amino acid sequence alignment of DERAs from G. thermodenitrificans A. pernix (Q9Y948),P. aerophilum (Q8ZXK7), and T. maritima (Q9X1P5)

2.3 基本酶学性质

最适pH的表征结果表明，DERAGth的最适pH为7.5，从最适pH的曲线中可以看到，DERAGth在pH9.5附近还有另外一个钟形顶点存在(图3)，这表明该酶活性中心附近存在强电荷残基，根据第二个钟性顶点出现在pH9.5附近，推测其活性位点周围最可能存在其它的如His、Lys或Arg残基，这些残基的带电基团发生了解离，进而叠加影响了活性中心残基的解离系数，表现为双钟形pH曲线.DERAGth是目前为止唯一一个具有双钟形pH曲线的DERA醛缩酶.最适温度的测定表明，该酶的最适温度为60 ℃.在不同温度下保温10 min，可以看到该酶的热稳定性较高，在60 ℃保温10 min后，酶活性完全没有损失，但是70 ℃条件下活力处于完全失活状态(图4).与目前已经克隆和表征的常温醛缩酶相比较[9,11]，该酶热稳定性上表现出明显的优势，但是与P.aerophilum和T.maritime来源的嗜热醛缩酶相比[11]，其稳定性稍差，后两者在90 ℃下保温10 min活力仍然保持在100%.

图3 pH值对活力的影响Fig. 3 Effects of pH on activities of DERAGth

图4 温度-活力曲线图Fig. 4 Effects of temperature on stability(●) and activity(■) of DERAGth

2.4 乙醛耐受性

乙醛的耐受实验结果显示，该酶在300 mmol乙醛浓度下，30 min内保持了高于50%的剩余活力，在经过2 h后，其剩余活力仍大于40%，到达4 h后剩余活力下降为20%，其后至20 h不再出现下降.从其活力下降的曲线可以看到，在0—1 h的区间内，活力下降速度最高，1 h内下降了约60%，但是在1—8 h的区间内，平均每小时活力下降不超过3%(图5)，这表明随着时间的延长，大量的乙醛底物被醛缩酶转化为内酯产物，降低了变性剂乙醛的浓度，进而导致酶失活速率的下降.与来源于P.aerophilum和T.maritime的DERA相比较，DERAGth的耐乙醛变性能力稍弱，但是P.aerophilum和T.maritimeDERA的耐乙醛实验结果显示，在同样条件下，后两者进入变性速率下降阶段至少要需要3 h[11]，由此可以推断在催化乙醛转化为内酯的速率上，来源于P.aerophilum和T.maritime的DERA催化速率要比DERAGth低.后续的连续醛缩活力的薄层色谱结果也提示，尽管DERAGth在稳定性上稍逊色于后两者，在同样高浓度乙醛条件下，三者的连续醛缩产物的量处于一个相当的水平，都远大于大肠杆菌来源的醛缩酶[11].

2.5 连续醛缩活力

为了进一步确定DERAGth的连续醛缩性能，笔者通过薄层色谱法检测其内酯产物的大致含量.同时，将连续醛缩性能研究最为详细的大肠杆菌醛缩酶作为对照组，结果显示在25 ℃条件下，经过4 d的暗室反应.由薄层色谱结果可以看到，大肠杆菌的目标条带中基本看不到产物，而DERAGth的产物目标条带已经非常明显(图6).同样，文献报道过P.aerophilum和T.maritime的醛缩酶也在相同条件下与大肠杆菌比较过连续醛缩活力，其结果与在实验中确定的结果是类似的，嗜热来源的醛缩酶活力都明显高于大肠杆菌来源的常温醛缩酶[11].

图5 乙醛对酶稳定性的影响Fig. 5 Effect of acetaldehyde on enzyme stability

图6 连续醛缩的产物薄层色谱分析Fig. 6 TLC analysis of the products of aldol condensation by DERAs

3 结 论

该实验克隆、表达和初步表征了来源于Geobacillusthermodenitrificans的嗜热醛缩酶DERAGth，作为嗜热来源的醛缩酶，DERAGth的热稳定性方面与国际上已报道的嗜热醛缩酶相比并无优势，但是在对抗乙醛变性的实验中，该酶表现出较高的乙醛耐受和对乙醛底物的转化活力，两者共同作用表现在高浓度乙醛催化反应中内酯产物的高产量.因此综合考虑其对乙醛的较好抗性和较高活力的分子性质，DERAGth可以作为开发催化乙醛底物连续醛缩反应工业工艺一个比较理想的催化剂选择起点，期望可以通过进一步的酶固定化、蛋白质工程和反应介质优化等手段，将DERAGth开发为可以工业应用的催化剂.

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