苦参提取物对小麦防御性关键酶活性的影响

刘姬艳，刘如东，胡定慧

(1.杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036；2．四川省绵阳市农业局 植保植检站，四川 绵阳 621000；3．绵阳师范学院 生命科学与技术学院，四川 绵阳 621000)

苦参(SophoraFlavescensAit)系豆科槐属植物，是我国常用的传统药物，苦参碱有清热、去湿、杀虫、利水、抗肿瘤之功效[1-2].近年来，随着对苦参作用机理研究的不断深化,苦参碱已经广泛应用于农药的生产上[3].

小麦条锈病是我国小麦生产中常见的一种病害.课题组前期研究显示，苦参提取物对小麦条锈病有很好的防治作用(另文发表)，并对小麦条锈病菌有较好的抑制作用[4].

文章旨在研究不同浓度苦参提取物对小麦叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等防御性关键酶活性的影响，从而认识苦参提取物提高小麦抗性的生理机制.

1 材料和方法

1.1材料苦参，购于中药市场(批号：20060715)；供试小麦品种为易感条锈病的绵阳29号，由绵阳市梓潼县植保站提供；苦参碱对照品，购于四川维克奇生物科技有限公司，批号为110805-200507.

1.2仪器SPX-150B-2生化培养箱(上海康华生化仪器制造厂)，JTL2001电子天平(上海精天电子仪器有限公司)，KH-600DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，自动搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司).

1.3苦参水提液的制备与定量取苦参粉100 g加水煮沸1.5 h，过滤得药液.沉淀重复处理3次，收集药液，3 000 r/min离心5 min，取上清液，减压浓缩药液至50 mL左右，于4 ℃冷藏备用[5].采用溴甲酚绿比色法[6]测定苦参碱含量.以苦参碱量浓度为横坐标，以苦参碱与溴甲酚绿反应后的溶液在420 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线.将提取的苦参水提液与溴甲酚绿反应后同样在420 nm处测吸光度，所得的数据代入标准曲线，计算得苦参水提液中的苦参碱含量.

1.4小麦幼苗培养和试验处理选取饱满小麦种子用75%乙醇消毒、自来水冲洗、蒸馏水浸种4 h后，于25 ℃的培养箱中培养.待小麦幼苗长至约1 cm时，将提取的苦参液倍比稀释后分组等量喷洒，对照组用等量蒸馏水代替，每组各3个重复.分别于喷洒后12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、11 d取材测定酶活性.

1.5酶活性测定取小麦幼苗叶片经蒸馏水冲洗吸干，称取1 g鲜样加6 mL 0.1 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液于冰浴中研磨，4 ℃下4 000 r/min离心15 min，取上清液测定CAT、POD、PAL活性.CAT活性采用紫外吸收法[7]测定，POD活性采用愈创木酚氧化法测定[8]，PAL活性的测定参照张志良的方法[8].所有测定重复3次.

2 结果与分析

制备的苦参水提取液中苦参碱质量分数为1.26 mg/g.用蒸馏水倍比稀释成0.63 mg/g、0.315 mg/g、0.157 5 mg/g的不同浓度后等量喷洒小麦幼苗，以等量蒸馏水喷洒为对照取材测定酶活性.

2.1 苦参提取物对小麦幼苗CAT活性的影响

图1 不同含量苦参碱处理后小麦叶片CAT活性变化Fig. 1 CAT activities of wheat leaves at different Matrine alkaloids

在测试期内随着时间的变化，对照组小麦幼苗的过氧化氢酶活性略有升高，但总体变化不大(图1).苦参提取物喷洒后，小麦幼苗叶片内的CAT总体水平高于对照组，其活性随着时间推移逐渐升高，在第7d出现峰值，之后逐渐降低.其中质量分数为0.315 mg/g的苦参提取液处理7 d时峰值最高，CAT活性比对照组增加了74.91%.

2.2 苦参提取物对小麦幼苗POD活性的影响

在整个取样时期，苦参提取物可明显提高POD活性.图2结果显示，处理24 h后小麦幼苗POD活性明显增加，4 d后急剧增加，第7 d出现峰值，之后逐渐降低，11 d时降至对照水平.第7 d时，质量分数为0.157 5 mg/g、0.315 mg/g、0.63 mg/g的苦参提取液处理后的POD活性分别为104、135、155 U/(g·min FW).可见，苦参提取物处理对POD活性的提高效果与含量相关.

图2 不同含量苦参碱处理后小麦叶片POD活性变化Fig. 2 POD activities of wheat at different Matrine alkaloids

图3 不同含量苦参生物碱处理后小麦叶片PAL活性变化Fig. 3 PAL activities of wheat at different Matrine alkaloids

2.3 苦参提取物对小麦幼苗PAL活性的影响

苦参提取物可明显提高小麦幼苗内PAL活性.从图3可以看出，苦参提取物处理后，PAL活性随着时间推移逐渐增加，同样在7 d左右出现峰值，之后逐渐下降.而苦参提取物处理小麦幼苗后，对PAL活性的提高效果与含量无相关性，0.315 mg/g苦参碱含量的苦参提取液处理后的PAL活性最高.第7 d时，质量分数为0.1575 mg/g、0.315 mg/g、0.63 mg/g的苦参提取液处理后的PAL活性分别为289、345、222 U/(g·h FW).

3 讨 论

CAT、POD、PAL参与植物体内多种生理代谢过程，其活性与植物的防御反应及抗病性密切相关[9-10].POD活性的增加与木质素类物质的积累有关，可构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害.PAL是木质素与植保素沿苯丙烷类代谢途径合成的关键调节酶，能增强植物对病原侵染的抵抗能力.试验结果表明，喷洒不同的苦参提取物后，小麦体内的CAT、POD和PAL活性较对照都有不同程度的增加，酶活性的高峰期大多出现在处理后的7d，说明苦参提取物对小麦植株的这3种防御酶具有明显诱导作用.用不同苦参提取物喷洒小麦幼苗，结果表明，质量分数为0.315 mg/g的苦参提取液处理后3种防御酶的总体水平达到最高.

由于对多种病菌具有较强的杀菌活性，目前苦参碱已广泛应用于农药的生产上，而其对于提高植物抗性的研究还较少.另外，该研究供试材料小麦，是在实验室采用水培法培养的，培养条件受到各种因素的限制.因此课题组将在大田中进一步进行实验验证，为更深入探究苦参碱提高小麦抗性机理打下基础.

[1] 李丹,王平全,张楠森,等.苦参碱类生物碱的研究进展及临床应用[J].中草药,1996,27(5):308-309.

[2] 刘姬艳,胡定慧.苦参总碱对血管生成抑制作用的初步研究[J].杭州师范大学学报：自然科学版，2008,7(6):453-455.

[3] 郑永权,姚建仁,邵向东.苦参化学成分及农业上应用研究概况[J].农药科学与管理,2000,21(1):24-26.

[4] 胡定慧,徐兴全,王小松,等.苦参提取液对小麦条锈病菌的抑制作用[J].江苏农业科学,2008，6:120-122.

[5] 崔鹦,张懿,胡春梅.苦参生物碱的提取与分离[J].重庆工学院学报:自然科学版,2007,21(3):113-116.

[6] 孟祥松,时军.溴甲酚绿比色法测定苦参总碱含量的研究[J].安徽医药,2007,11(1):41-42.

[7] 邹琦.植物生理生化实验指导[M].北京：中国农业出版社，1995：168-169.

[8] 张志良.植物生理学实验指导[M].3版.北京:高等教育出版社,2003:123-278.

[9] 张庆春,李永才,毕阳,等.柠檬酸处理对马铃薯干腐病的抑制作用及防御酶活性的影响[J].甘肃农业大学学报,2009，3(44):146-150.

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