禽腺病毒家禽分离株的生物学特性

张明明,王小辉,秦爱建

(扬州大学兽医学院,江苏扬州225009)

禽腺病毒(fowl adenovirus,FAV)属腺病毒科(Adenoviridae),是鸡、鸭、鹅等禽类常见的传染性病原体之一。近年来,从鹦鹉、长尾鸭、肉鸡等禽类体内分离到了多种新的血清型FAV,某些病毒株还发生了变异[1-3]。陈溥言提出鸡胚致死孤儿病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELOV)已污染我国研究用和疫苗生产用非免疫鸡胚[4]。最近,周斌等用随机引物PCR方法从鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒中扩增出了污染的CELOV DNA片段,证实了这种污染的严重性[5]。本试验通过血凝试验、电镜技术、细胞病变以及动物试验等方法,研究了3株不同禽源的FAV分离株的病毒特性、形态特征和致病特点等,以期为了解其致病性和研制FAV基因工程疫苗提供条件。

1 材料与方法

1.1 材料 FAV分离株FAVI-C4-YZ0605、FAVI-D4-YZ0605和FAVI-G24-YZ0605分别采自江苏省扬州市活禽市场外表健康的鸡群、鸭群和鹅群,其分离、鉴定和鸡胚扩增由江苏省动物预防医学重点实验室完成。SPF鸡胚购自山东省无特定病原种鸡场,由江苏省动物预防医学重点实验室孵化至使用日龄。1日龄SPF鸡购自中牧集团南京药械厂。鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肾细胞(CEK)生长所需的基础培养基DMEM购自Gibco公司。透射电镜由扬州大学测试中心提供。

1.2 病毒形态观察 FAV鸡胚尿囊液中加入1/10体积的氯仿,充分混匀,3 000 r/min离心5 min后,吸取上清,重复此步骤直至分层之间无白色沉淀。然后将上清装入透析袋中,外层包裹 PEG-6 000浓缩至一定体积后,收集到指形管中,加入1/10体积的氯仿继续抽提直至分层之间无白色沉淀。取少量上清,负染后,透射电镜观察病毒的形态结构。

1.3 细胞致病性试验 常规方法制备CEK或CEF单层细胞。用 DMEM 培养基1∶100稀释FAV尿囊液,将0.2 mL病毒稀释液分别接种24孔细胞培养板上的CEK或CEF单层细胞,同时设未接种对照。37℃5%CO2培养箱吸附2 h后,弃去病毒吸附液,补加含1%新生牛血清的DMEM,继续培养5 d,每天于倒置显微镜下观察细胞病变。吸取接种CEF的病毒上清,重新接种新鲜的CEF细胞,按上述方法连续传5代。

1.4 鸡胚致病性试验 分别将0.2 mL FAV尿囊液通过绒毛尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚,置37℃温箱孵育5～6 d后收获尿囊液。通过此方法连续传代以提高病毒滴度,同时观察病毒对鸡胚生长的影响及其致病性。

1.5 鸡体致病性试验 FAVI-G24-0605株尿囊液TCID50的测定参照文献[6]进行。以每只鸡1.0×1010TCID50的剂量,分别通过皮下和口服2种途径各接种于10只1日龄SPF鸡,并设生理盐水阴性对照。接种后,每天观察鸡只的表现,并分别于10日龄、20日龄和30日龄各取2只不同接种途径的小鸡,称量活体重,剖杀后取胸腺、腔上囊、脾等免疫器官称重,并取心、肝、肺、肾、腔上囊等器官制作病理切片,观察组织病变情况。

2 结果

2.1 病毒形态 经透射电镜观察FAV分离株,可以观察到球形、无囊膜、直径为70～80 nm的病毒粒子,具有腺病毒典型的二十面体结构,符合腺病毒的形态特征。图1为FAVI-G24-0605分离株在电镜下的形态。

图1 禽腺病毒FAVI-G24-YZ0605分离株的电镜形态A：13 000 ×;B：19 000 ×

2.2 FAV分离株在CEK和CEF上的细胞病变FAVI-C4-YZ0605、FAVI-D4-YZ0605 和 FAVI-G24-YZ0605均不能引起CEF细胞的眼观病变,细胞生长良好;在接种24 h左右,CEK细胞开始出现细胞病变,表现为细胞变圆、聚集、折光性增强等,对照CEK细胞则看不到类似的细胞病变,只有少量因衰老或制备原因而死亡的细胞碎片(见前插彩版图2)。

2.3 FAV分离株对鸡胚的致病性 鸡胚接种病毒后,未见出血等眼观病变,也未造成鸡胚生长发育迟缓。在鸡胚上进行病毒扩增时,P1代和P2代病毒的滴度下降,盲传3代后,重新检测到病毒。

2.4 FAV分离株对SPF鸡的致病性

2.4.1 FAV分离株对鸡体生长发育和免疫器官的影响 在10日龄时,攻毒组的鸡只平均体重均明显轻于对照组;在20日龄和30日龄时,攻毒组和健康对照组的鸡只平均体重无明显差异(表1)。通过比较主要免疫器官的重量,发现10日龄攻毒组鸡只的各免疫器官的平均重量略低于对照组;在20日龄和30日龄时,各组鸡只免疫器官的重量基本一致。

2.4.2 FAV分离株对SPF鸡的致病性 试验过程中,未发现试验鸡有明显的临床症状。组织病理切片结果(见前插彩版图3)表明,10日龄攻毒组鸡只的肝组织结构完整,肝索肿胀,肝血窦变得狭窄,甚至闭塞,肝细胞浑浊肿胀,部分细胞发生水泡变性或空泡化,对照组鸡只肝组织正常;20日龄后,肝、肾、腔上囊、心和肺的组织结构均正常。

表1 不同攻毒组SPF鸡在不同日龄的活重和免疫器官重量 (g)

3 讨论

传统上,根据血清型差异将FAV分为3个亚群,不同亚群FAV凝集动物红细胞的特性不同。本试验中,3株FAV分离株均不能凝集鸡红细胞,与I群FAV不能凝集禽类红细胞的特征一致,是否凝集其他动物的红细胞有待进一步补充。多数FAV可以在CEK或CEF细胞上增殖,也可以经卵黄囊、绒毛尿囊膜或尿囊腔接种鸡胚进行增殖,部分毒株可以引起鸡胚病变。本试验中,3株FAV分离株均不能引起CEF的细胞病变,而在CEK上可以引起典型的FAV细胞病变,表现为细胞变圆,聚集成葡萄串状,折光性增强,严重时细胞脱落。通过鸡胚接种,可以分离Ⅰ群FAV,但是不易分离到Ⅱ群和Ⅲ群FAV。Ⅰ群FAV通常引起鸡胚充血或出血、发育不良、胚体蜷曲、不同程度的肝炎和脾肿大等。本试验中,3株FAV分离株对鸡胚没有明显的致病作用,这与多数Ⅰ群FAV分离株的特性不完全一致。此外,鸡胚扩增病毒时,前1～2代的病毒滴度下降,某些病毒株在前3代甚至检测不到病毒,盲传后才重新检测到病毒,推测这可能是病毒初次分离时不适应鸡胚所致。

多数FAV分离株在禽体内复制却不致病或仅引起轻微的病症,当有其他诱因或是发生混合感染时,也可能影响禽群健康。研究表明,注射 Ⅰ群FAV可能致死1日龄鸡,而对10日龄鸡不具有致死性[7]。本试验通过大剂量皮下注射和口服2种途径接种1日龄SPF鸡,试验鸡在感染FAV后,未出现明显的临床症状。在10日龄时,皮下注射和口服攻毒的小鸡体重均明显轻于对照组,而在20日龄和30日龄时,各组体重没有明显的差异,这表明FAVI-G24-YZ0605分离株对SPF鸡体重影响不大,呈一过性。

某些腺病毒毒株感染可能引起免疫器官的变化,导致了腔上囊、胸腺和脾中的淋巴细胞发生严重的退行性变化,引起免疫损伤[8]。本试验中,10日龄攻毒组鸡只的主要免疫器官重量略低于对照组;在试验后期,各组免疫器官的重量基本一致。组织病理学切片观察结果表明,除部分器官有轻微病变,大部分器官基本没有病变,后期各组织器官均正常。这表明FAVI-G24-YZ0605没有明显抑制免疫器官的生长,仅是一过性的变化,也不引起可见的病理损伤。由体内外试验可知,FAV分离株的致病性低,生物安全性高,可能是较好的FAV载体。

虽然在1日龄可以分离到腺病毒,但通常在3周龄以后排出病毒,粪便中的病毒滴度较高。本试验中,采集了不同时期的棉拭子,对鸡体的排毒情况尚需检测。此外,禽类被感染后迅速产生中和抗体,可以在1周龄时检测到抗体,3周龄时抗体水平达到最高峰[9]。因此,攻毒后机体的抗体水平也是需要进一步检测的项目。

[1] Raue R,Gerlach H,Müller H.Phylogenetic analysis of the hexon loop 1 region of an adenovirus from psittacine birds supports the existence of a new psittacine adenovirus(PsAdV)[J].Arch Virol,2005,150(10)：1933-1943.

[2] Hollmén T E,Franson J C,Flint P L,et al.An adenovirus link ed to mortality and disease in long-tailed ducks(Clangula hyemalis)in Alaska[J].Avian Dis,2003,47(4)：1434-1440.

[3] Guy J S,Barnes H J,Smith L,et al.Partial characterization of an adenovirus-like virus isolated from broiler chick ens with transmissible viral proventriculitis[J].Avian Dis,2005,49(3)：344-351.

[4] 陈溥言.禽腺病毒1型(鸡胚致死孤儿病毒)在非免疫鸡胚中隐性感染可能己经严重危害到我国疫苗生产[J].畜牧与兽医,2002,34(6)：19.

[5] 周斌,曹瑞兵,卢银华,等.随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA的研究[J].中国病毒学,2003,18(2)：137-140.

[6] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社,1997：329-331.

[7] Cook J.Pathogenicity of avian adenovirus for day-old chicks[J].J Comp Pathol,1974,84：505-515.

[8] Schonewille E,Singh A,Göbel T W,et al.Fowl adenovirus(FAdV)serotype 4 causes depletion of B and T cellsin lymphoid organs in specific pathogen-free chickens following experimental infection[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,121(1-2)：130-139.

[9] Yates V J,Rhee Y O,Fry D E.Serological response of chickens exposed to a type 1 avian adenovirus alone or in combination with the adeno-associated virus[J].Avian Dis,1977,21(3)：408-414.