出入境口蹄疫检测方法的比较

王玉玲,赵祥平,王国柱,陈本龙,刘红梅,柴铭骏,杨新梅

(1.天津出入境检验检疫局,天津 塘沽 300461;2.河北出入境检验检疫局,河北 廊坊 050051)

2009年4月,我国首次从乌拉圭进口种牛,依据双边签订的检疫和卫生要求议定书,须进行口蹄疫的检疫。议定书中规定,在农场检疫和隔离检疫期间对动物逐头进行口蹄疫非结构蛋白检测,若在口蹄疫的非结构蛋白检测中发现有阳性动物,则立即从牛群中剔除,并对这些阳性动物进行病毒分离试验,如仍为阳性,则立即停止向中国出口活牛。经过中乌双方协商,在产地检疫时,对该批种牛采用世界卫生组织(WHO)PANAFTOSA实验室提供的FMD非结构蛋白检测系统,先用口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体间接ELISA检测方法筛选,对筛选出的阳性和可疑样品再用酶联免疫电转移印迹试验(enzyme-linked immunotransfer blot,EITB),进行确认。在进境隔离检疫时,对该批种牛采用了同样的方法进行检测,同时我们还对口蹄疫其他检测方法进行了应用研究,以期寻求到在出入境检疫或临床检疫中更为有效的、操作更为简便的口蹄疫检疫方法。

1 材料与方法

1.13 ABC非结构蛋白抗体间接ELISA试验 用巴西PANAFTOSA实验室提供的口蹄疫3ABC非结构蛋白间接ELISA试剂盒,对3955份种牛血清样品进行检测。方法按照试剂盒说明书操作。

1.2 酶联免疫电转移印迹试验 用巴西PANAFTOSA实验室提供的EITB试剂盒,对1.1试验中阳性的血清样品进行口蹄疫非结构蛋白3ABC、3D、2C、3B、3A的EITB检测。方法按照试剂盒说明书操作。

1.33 ABC非结构蛋白抗体阻断ELISA试验 用荷兰Cedi生产的口蹄疫非结构蛋白3ABC阻断ELISA试剂盒,对1.1试验中阳性的血清样品进行检测。方法按照试剂盒说明书操作。

1.4 实时荧光RT-PCR试验 用深圳太太基因工程有限公司生产的口蹄疫病毒通用型实时荧光RTPCR检测试剂盒,对1.3试验为阳性的种牛采集抗凝血进行检测。方法按照试剂盒说明书操作。

2 结果与分析

2.13 ABC非结构蛋白抗体间接ELISA试验

3955份样品中,95份为阳性反应,阳性百分率为2.4%。在乌拉圭农场检疫和隔离检疫时,阳性百分率分别为4.5%和0.9%,说明在国内隔离检疫时3ABC间接ELISA试验的阳性百分率,与国外检疫时的基本相符(见表1)。

表1 巴西口蹄疫检测试剂盒的检测结果

2.2 酶联免疫电转移印迹试验 对2.1中筛选出的95份阳性血清样品进行EITB检测,结果(见表2)是95份样品均为EITB试验阴性,依此最终判定95份样品为口蹄疫阴性。说明2.1中筛选的95份为口蹄疫非特异性反应。

2.33 ABC非结构蛋白抗体阻断ELISA试验 对2.1中筛选出的95份阳性血清样品进行口蹄疫3ABC非结构蛋白阻断ELISA检测,结果有1份样品(样品号为42)为阳性反应,其余94份样品为阴性反应。

2.4 实时荧光 RT-PCR试验 对42号动物采集抗凝血,同时采集了19头种牛抗凝血,进行口蹄疫实时RT-PCR检测,结果是42号样品和另外19份样品均为阴性。该19份样品为巴西PANAF TOSA 3ABC非结构蛋白间接ELISA阳性,荷兰Cedi口蹄疫3ABC非结构蛋白阻断ELISA阴性。结果说明,荷兰Cedi ELISA检测的结果与RT-PCR符合率较高。

3 讨论

图1 口蹄疫实时荧光RT-PCR检测结果

3.1 口蹄疫的实验室诊断方法主要有病原鉴定和血清学试验,病原鉴定主要有病毒分离、免疫学方法和核酸识别方法,血清学试验主要有病毒中和试验、ELISA、EITB试验[1]。病毒分离及病毒中和试验都需要用到口蹄疫病毒毒株,需在许可的具有资质的生物安全三级实验室进行,此类试验的应用受到限制。免疫学方法在病原鉴定时由于涉及到样品采集的限制也很少被采用。基于此,我们主要对核酸识别方法、ELISA和EITB在实际检测中进行了应用研究。目前在口蹄疫出入境检疫或临床检疫时,通常是先采用血清学试验进行检测,出现阳性结果的样品再采用病原鉴定的方法进一步确诊。

3.2 从表1中可以看出,不论是在国内隔离检疫还是在国外农场检疫和隔离检疫,用3ABC间接ELISA筛选出的阳性样品,经EITB确认后均为阴性,说明巴西PANAFTOSA的3ABC非结构蛋白间接ELISA试剂盒的假阳性率较高。

表2 EITB检测结果

EITB是将 3ABC、3D、2C、3B、3A 蛋白固定在硝化纤维素条带上,当血清样品中有特异抗体时,产生抗原抗体免疫复合体,与结合物结合后,加入底物发生颜色反应,与弱阳性对照上条带比对,如果在3ABC、3D、3B、3A 处都产生条带,且颜色等于或深于弱阳性对照时,判定该样品为EITB阳性。

由于EITB是一种免疫印迹试验,其结果比3ABC非结构蛋白间接ELISA方法更加准确。在南美被广泛应用的血清学检测体系时,先用3ABC非结构蛋白间接ELISA进行口蹄疫筛选试验,然后用EITB作确认试验。但EITB操作较复杂,判定结果时需眼观判定,受主观因素影响较强。

3.3 从荷兰Cedi 3ABC非结构蛋白阻断ELISA检测的结果看,95份样品中只有1份为阳性反应,94份均检测为阴性,说明该试剂盒假阳性反应较少。据文献报道[2],对市售的 UBI、Chekit、Cedi三种ELISA非结构蛋白试剂盒进行比对,结果说明荷兰Cedi 3ABC阻断ELISA的特异性和敏感性是最高的,与疫苗中残留的非结构蛋白的反应也是最低的。通过试验结果说明,荷兰Cedi3ABC非结构蛋白阻断ELISA检测的结果最符合种牛机体口蹄疫感染的实际情况。建议在出入境检疫或临床检疫中可将荷兰Cedi 3ABC非结构蛋白阻断ELISA作为首选的口蹄疫血清学检测方法。

3.4 通过2.4试验结果可以看到,42号和另外采集的19份抗凝血样品均为 RT-PCR阴性,与流行病学观察的结果相符(经临床观察,20头牛健康状况良好,无任何疾病症状)。有文献证明[3],实时RT-PCR的敏感性可比得上病毒分离。通过实际应用,实时荧光RT-PCR不涉及到口蹄疫病毒毒株,且方法快速简便,敏感性和特异性较高,可用于临床检疫中的口蹄疫病原鉴定。建议对血清学检测为抗体阳性的动物采用实时荧光RT-PCR方法进行口蹄疫病原检测。

[1] OIE.Man ual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[EB/O L].http://ww w.oie.in t/en_index.h tm,2009-8-26.

[2] Chen S P,Ellis T M,Lee M C,et al.Com parison of sensitivity and specificity in th ree commercial foot-and-mouth disease virus non-structu ral protein E LIS A kits with sw ine sera in Taiw an[J].Vet Microbiol,2007,119(2-4):164-172.

[3] Reid S M,G rierson S S,Ferris N P,et al.Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of footand-m ou th disease virus[J].J Virol M ethods,2003,107(2):129-139.