硒化壳聚糖与阿霉素联合及序贯给药对NB4细胞增殖的影响

邓守恒, 杨敬宁, 曹凤军, 蔡晓军, 邓守平, 陈 萍*

(1郧阳医学院附属人民医院肿瘤中心, 十堰 442000; 2郧阳医学院免疫教研室; 3郧阳医学院附属人民医院消化内科; *通讯作者,E-mail:yychenping@163.com)

自20世纪80年代中期全反式维甲酸(ATRA)被用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)以来,APL预后已发生根本性变化。目前,联合应用 ATRA和化疗已可使约 70%的APL患者得到根治,砷剂的应用能使部分复发的患者再次获得缓解,APL已成为仅靠化疗就可治愈的一种急性白血病[1]。尽管如此,仍有 30%的患者有可能复发。如何改进治疗方案,进一步提高 APL疗效,仍是目前研究的热点。无机硒亚硒酸钠可通过诱发氧化应激反应对体外培养的APL细胞株 NB4产生诱导凋亡作用[2],然而存在着不易被细胞吸收,活性和毒性范围较窄,致死量相对较小等缺点而应用受限,硒化壳聚糖[3]是一种有机硒,可有效克服无机硒的上述缺点,研究发现它对NB4增殖亦具有显著抑制作用[4]。由于联合用药是化疗的一个基本原则,笔者观察了硒化壳聚糖与阿霉素(ADM)联合及序贯合用对NB4细胞增殖产生的不同影响,为硒化壳聚糖治疗 APL奠定基础。

1 材料和方法

1.1 药品试剂与仪器 硒化壳聚糖由福建医科大学药化系合成,含硒量为0.4%;阿霉素(浙江海正药业);噻唑喃(MTT)为Sigma公司产品;其他试剂均为进口分装分析纯;DG-3022型酶标仪(购于南京)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人急性早幼粒细胞性白血病细胞株 NB4细胞由福建省血液病研究所提供,培养于含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 U/ml谷氨酰胺的RPMI1640培养基内,于 37℃、饱和湿度,5%CO2条件下培养,细胞接种 24 h后即处于指数生长期。

1.2.2 联合给药对细胞的作用 处于指数生长期单细胞悬液按 1×105/孔接种于 96孔板,接种量100μl。分别设空白、硒化壳聚糖 50,100 mg/L,ADM 0.5,1,2 mg/L单独作用浓度及二者联合作用浓度组,给药后各孔终体积相同,每个浓度重复 4孔,置 5%CO2,37℃培养箱中孵育 24 h,MTT法测定联合用药对细胞增殖的作用。

1.2.3 序贯给药对细胞的作用 处于指数生长期细胞先给予硒化壳聚糖 50,100 mg/L作用 24 h,再给予 ADM(0.5,1,2 mg/L)作用 24 h,或者先给予ADM(0.5,1,2 mg/L)作用 24 h,再给予硒化壳聚糖50,100 mg/L作用 24 h,每种浓度重复 4孔,MTT法测定对细胞增殖的作用。

1.2.4 数据分析及统计 以金氏公式[5]q=E(a+b)/[(Ea+Eb)-Ea×Eb]评价药物合用对体外细胞毒是否有协同作用:q值为0.85-1.15为单独相加(+),q值为1.15-2.0为增强(++),q＞2.0为明显增强(+++),q＜0.85-0.55为拮抗(-),q＜0.55为明显拮抗(--)。数据以±s表示,应用 SPSS12.0统计软件进行 t检验。

2 结果

2.1 联合给药对细胞增殖的抑制作用 硒化壳聚糖 50,100 mg/L对NB4细胞抑制率分别为38.3%,59.1%;ADM 0.5,1,2 mg/L抑制率分别为9.6%,11.7%和34.6%。硒化壳聚糖与 ADM合用的抑制率均大于两药相应浓度单独作用组(均 q＞1),有协同作用,50 mg/L硒化壳聚糖对各浓度 ADM均可产生增强作用,随着硒化壳聚糖浓度的升高,协同作用似有所下降,见表1。随着 ADM浓度的升高,可通过斜率增大与最大效应值增高的方式使硒化壳聚糖的量效关系曲线向左上方移动,效能、效价均高于硒化壳聚糖单独作用的量效曲线,随着 ADM浓度的升高,曲线向左上方移动的幅度下降,当 ADM 2 mg/L时,硒化壳聚糖的量效关系曲线基本不再上移,即此浓度的ADM对硒化壳聚糖的协同作用已达到坪值,见图1。随着硒化壳聚糖浓度的升高,主要通过基线垫高的方式使 ADM的量效关系曲线向左上方大幅度移动,硒化壳聚糖可显著增强 ADM对NB4细胞的杀伤作用,随硒化壳聚糖浓度的升高,协同效果下降的现象同样可见,见图2。

表1 硒化壳聚糖与ADM同时合用对NB 4细胞抑制的协同作用 (±s,n=4)Tab 1 The synergistic inhibitory effect on NB4 cell proliferation after administration of selenium chitosan and ADM at the same time (±s,n=4)

表1 硒化壳聚糖与ADM同时合用对NB 4细胞抑制的协同作用 (±s,n=4)Tab 1 The synergistic inhibitory effect on NB4 cell proliferation after administration of selenium chitosan and ADM at the same time (±s,n=4)

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图1 ADM对硒化壳聚糖抑制 NB4细胞增殖量效关系曲线的影响Fig 1 The influenceof ADM on dose-effect curve of selenium chitosan inhibiting NB4 cell proliferation

图2 硒化壳聚糖对ADM抑制 NB4细胞增殖量效关系曲线的影响Fig 2 The influenceof selenium chitosan on dose-effect relationship curve of ADMinhibiting NB4cell proliferation

2.2 序贯给药对细胞增殖的作用

2.2.1 硒化壳聚糖-ADM序贯给药结果 往 NB4细胞中先加硒化壳聚糖作用24h,再加 ADM作用24 h呈单纯相加至增强效应,随ADM浓度提高,协同作用逐渐下降(见表2)。与同时给药相似,经硒化壳聚糖作用后再加入ADM,后者可使硒化壳聚糖的量效关系曲线向左上方移动,最大效应值与效能均增大,然而,序贯联合的最大效应值均低于两药同时合用的最大值,见图3。先用硒化壳聚糖同样可使后续给药的ADM的量效曲线向左上方移动,尤其可使 ADM量效曲线低浓度段的斜率明显增加,提示硒化壳聚糖对低浓度 ADM的协同作用更明显,在硒化壳聚糖作用的基础上,低浓度的ADM就可产生较高的效应,见图4。

表2 硒化壳聚糖-ADM序贯联合用药对NB 4细胞的协同抑制作用 (±s,n=4)Tab 2 The inhibitory effect on NB 4cell proliferation after sequential administration of selenium chitosan and ADM (±s,n=4)

表2 硒化壳聚糖-ADM序贯联合用药对NB 4细胞的协同抑制作用 (±s,n=4)Tab 2 The inhibitory effect on NB 4cell proliferation after sequential administration of selenium chitosan and ADM (±s,n=4)

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图3 硒化壳聚糖-ADM序贯联合用药,ADM对硒化壳聚糖抑制 NB4细胞增殖量效关系曲线影响Fig 3 The influence of ADM on dose-effect relationship curve of selenium chitosan inhibiting NB4 cell proliferation after sequential administration of selenium chitosan and ADM

图4 硒化壳聚糖-ADM序贯联合用药,硒化壳聚糖对ADM抑制NB4细胞增殖量效关系曲线影响Fig 4 The influence of selenium chitosan on dose-effect relationship curveof ADM inhibiting NB4cell proliferation after sequential administration of selenium chitosan and ADM

2.2.2 ADM-硒化壳聚糖序贯给药结果 先加ADM 24 h后再加入硒化壳聚糖作用 24 h呈拮抗至单纯相加效应,拮抗效应随 ADM浓度增高逐渐减弱。加硒化壳聚糖后的抑制率有的甚至低于 ADM相应浓度单独作用的抑制率(见表3)。在 ADM作用的基础上再给硒化壳聚糖,可使 ADM量效关系曲线在低浓度段呈现下降的负量效关系,表现出不同浓度硒化壳聚糖对低浓度 ADM预处理的拮抗效应,随着 ADM浓度的升高,硒化壳聚糖拮抗作用减小,ADM的量效曲线逐步转为正量效关系,大多数ADM-硒化壳聚糖量效曲线的最大抑制率高于单纯ADM的最大抑制率,表明硒化壳聚糖对高浓度 ADM预处理可呈现一定的相加作用,见图5。当以低浓度ADM(0.5,1 mg/L)预处理后,ADM可拮抗后续硒化壳聚糖的作用,当 ADM浓度升至 2 mg/L时,对各浓度硒化壳聚糖又呈现一定的相加作用,见图6。

表3 ADM-硒化壳聚糖序贯联合用药对NB 4细胞增殖的抑制作用 (±s,n=4)Tab 3 The inhibitory effect on NB 4 cell proliferation after sequential administration of ADM and selenium chitosan (±s,n=4)

表3 ADM-硒化壳聚糖序贯联合用药对NB 4细胞增殖的抑制作用 (±s,n=4)Tab 3 The inhibitory effect on NB 4 cell proliferation after sequential administration of ADM and selenium chitosan (±s,n=4)

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图5 ADM-硒化壳聚糖序贯联合用药,硒化壳聚糖对ADM抑制 NB4细胞增殖量效关系曲线的影响Fig 5 The influence of selenium chitosan on dose-effect relationship curve of ADM inhibiting NB 4 cell proliferation after sequential administration of ADM and selenium chitosan

图6 ADM-硒化壳聚糖序贯联合用药,ADM对硒化壳聚糖抑制 NB4细胞增殖量效关系曲线的影响Fig 6 The influence of ADM on dose-effect relationship curve of selenium chitosan inhibiting NB4 cell proliferation after sequential administration of ADM and selenium chitosan

3 讨论

微量元素硒对化疗药物所致的毒副作用具有保护效应[6],但硒化壳聚糖与常用化疗药物合用的作用效果如何却未见有报道。ADM属蒽环类抗生素,能嵌入到 DNA碱基对之间,阻止转录过程,抑制RNA合成,也可阻止 DNA复制,属周期非特异性药物,是临床常用的化疗药物之一。

本文结果显示,硒化壳聚糖与 ADM同时合用对NB4细胞可产生单纯相加至增强的协同杀伤效果。50mg/L硒化壳聚糖与 1 mg/L ADM它们的单独抑制率分别是 38.3%和11.7%,同时合用则抑制率提高到 70.8%,呈现出增强的协同杀伤作用,且协同效果呈两药剂量依赖性提高,提示在临床应用时,硒化壳聚糖与 ADM同时合用,既可产生显著的协同效果,又可避免使用大剂量 ADM对病人产生的骨髓抑制及心肌损害等毒副作用,增加机体对化疗药物的耐受性。序贯给药时二者可产生单向协同,但协同效果不如同时合用显著,先给 ADM后给硒化壳聚糖,主要表现为序贯拮抗效应,原因可能是由于先加入的ADM抑制了细胞增殖,使细胞处于非增殖状态,而非增殖期细胞对硒化壳聚糖较耐受而引起的。先给硒化壳聚糖后再给 ADM则可产生协同作用,原因可能是硒化壳聚糖主要阻断细胞从G0-G1期向 S期转化[4],而 S期细胞则为ADM的最敏感杀伤时相之一[7],这样 ADM就可有效地杀伤那些侥幸逃过了 G0-G1期硒化壳聚糖对其产生的杀伤作用而进入S期的细胞,在 G0-G1期和S期两期同时对细胞产生杀伤作用,由此产生序贯协同。

根据药物受体动力学规律,若两药在任何剂量条件下合用均不超过其中强药的最大效应,则两药可能作用于同一受体[5]。硒化壳聚糖与 ADM同时合用对NB4细胞的抑制率均明显高于两药单独使用的抑制率,提示二药可能通过作用于不同受体对癌细胞产生杀伤作用,这些对进一步研究硒化壳聚糖的作用机制提供了线索。

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[3] 孙兰萍,张胜义,许晖.硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究[J].食品工业科技,2006,27(2):145-151.

[4] 邓守恒,孙各琴,陈崇宏.硒化壳聚糖对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞的作用及其机制探讨[D].福州:福建医科大学,2007.

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