乙酰半胱氨酸对急性酒精性肝损伤大鼠NF-κB和TNF-α的影响

田苗苗, 霍丽娟, 晋 阳

(山西医科大学第一临床医学院消化科, 太原 030001)

乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是天然存在的氨基酸 L-半胱氨酸乙酰化的衍生物,是一种极好的巯基供体。一直以来,临床上主要用于各种呼吸道疾病的治疗。但近年来 NAC对肝脏的保护作用日益受到重视,有研究表明 NAC作为核转录因子-κB(NF-κB)的活性抑制剂具有保护肝细胞、减轻肝组织病理损害的作用[1]。但对于乙酰半胱氨酸影响酒精性肝损伤时 NF-κB的表达,而对肝脏进行有效保护的报道尚少见。本文通过研究乙酰半胱氨酸对酒精诱导的大鼠急性肝损伤模型中 NF-κB表达和TNF-α含量的影响,来评价其对肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性 Wistar大鼠 50只,体重150-200 g,由山西医科大学生理实验室动物室提供。乙酰半胱氨酸注射液由杭州民生药业有限公司提供;56°白酒由北京顺鑫牛栏山酒厂生产。血清TNF-α放射免疫试剂盒购于北京普尔伟业生物科技有限公司;NF-κB p65免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物工程有限公司。全自动双探头放射免疫γ计数器由上海核所日环光电仪器有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 将50只大鼠随机分为5组,每组 10只:正常对照组、模型组、乙酰半胱氨酸低剂量组(150 mg/kg)、中剂量组(300 mg/kg)、高剂量组(600 mg/kg)。正常对照组用等剂量的生理盐水代替酒精灌胃和腹腔注射;模型组以 56°白酒 14 ml/kg体重灌胃,每日一次,连续 10 d;治疗组在酒精灌胃前 30 min分别腹腔注射不同剂量乙酰半胱氨酸,每日一次,连续10 d。各组大鼠实验期间均予普通饮食。

1.2.2 标本采集 各组大鼠最后一次给药后禁食14 h,用 25%乌拉坦腹腔注射麻醉,无菌消毒下打开腹腔,腹主动脉穿刺取血 5 ml,离心分离血清,-20℃保存;留取肝脏标本,用 4℃生理盐水冲洗,滤纸吸干后,以 10%甲醛溶液固定。

1.2.3 血清 TNF-α的测定 采用放射免疫法,由SN-697全自动放射免疫 γ计数器测定。

1.2.4 肝组织 NF-κB的测定 采用免疫组化法,具体步骤按 PV兔二步法检测试剂盒说明书进行。全部切片染色按相同条件进行。结果判定:光镜下观察,NF-κB细胞染色呈黄色或棕黄色为阳性,定位于细胞核和细胞质;不染色者为阴性,阴性对照用PBS代替一抗。每张切片随机选取 5个高倍镜视野(40×10),利用 MIAS-2000图像分析系统分析阳性区域平均光密度值(optical density,OD),以OD值大小代表阳性产物表达的多少。

1.3 统计学分析 应用 SPSS11.5统计分析软件进行统计分析,计量资料进行正态性检验,以x¯±s表示,方差齐性组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用 LSD法,P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 在实验期间,模型组大鼠毛发光泽度较差,体重增长缓慢,嗜睡。各治疗组毛发光泽度较好,体重增长较快,醒酒后行动敏捷。正常组大鼠全部存活,模型组和中剂量组各有 1只因灌胃时不慎致胃穿孔而死亡,高剂量组有 1只因酒精灌胃误入气管而死亡。

2.2 肝组织 NF-κB表达和血清 TNF-α含量的测定与正常组相比,急性酒精性肝损伤大鼠肝组织中NF-κB的表达明显增强,血清 TNF-α含量明显升高(P＜0.01),提示肝脏出现炎症反应。与模型组比较,乙酰半胱氨酸各剂量组肝组织中 NF-κB的表达明显减少,血清 TNF-α含量明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。与乙酰半胱氨酸低剂量组比较,中、高剂量组 NF-κB的表达减少(P＜0.01),高剂量组TNF-α含量降低(P＜0.01)。与中剂量组比较,高剂量组 NF-κB的表达减少(P＜0.05),TNF-α含量降低(P＜0.01,见表1)。

表1 各组大鼠肝组织 NF-κB表达和血清 TNF-α含量的比较 (±s)Tab 1 Comparison of NF-κB expression and serum TNF-αcontent between 5 groups (±s)

表1 各组大鼠肝组织 NF-κB表达和血清 TNF-α含量的比较 (±s)Tab 1 Comparison of NF-κB expression and serum TNF-αcontent between 5 groups (±s)

与正常组比较,*P＜0.01;与模型组比较,ΔP＜0.01,ΔΔP＜0.05;与 150 mg/kg组比较,□P＜0.01;与 300 mg/kg组比较,#P＜0.01,##P＜0.05

300 9 0.218±0.029*Δ□ 1.72±0.15*Δ 600 9 0.185±0.028Δ□## 1.32±0.12Δ□#

3 讨论

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)在我国的发病率逐年上升,严重危害人们的健康[2]。但其确切的发病机制尚未完全阐明,目前认为与酒精的直接毒性作用、氧自由基及内毒素损害、炎性细胞因子(如 TNF-α、IL-1)释放等多种因素密切相关。本实验通过观察不同剂量乙酰半胱氨酸对酒精诱导的急性肝损伤模型大鼠 NF-κB和TNF-α的影响来探讨乙酰半胱氨酸的保护作用及机制。

NF-κB是细胞中的一个重要转录因子,具有多向性调节作用,能与多种细胞基因的启动子和增强子的κB序列位点发生特异性结合,不仅介导多种炎性介质转录表达,也参与细胞凋亡的调控[3]。生理状态下,细胞中的NF-κB与抑制蛋白 IκB结合在一起留在细胞质中,处于未活化状态;当细胞受到外界因素,包括活性氧(ROS)、内毒素及各种致炎因子(如 IL-1、IL-6、TNF-α、NO)等[4]刺激时,细胞内的NF-κB激活 ,并与 IκB分离 ,进入细胞核内 ,启动多种基因的转录。NF-κB调控的基因可以编码急性反应蛋白、趋化因子、细胞因子和细胞黏附分子等,其中包括肿瘤坏死因子 α和β(TNF-α,β)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GCSF)、细胞间黏附分子(ICAM)等,这些产物可以直接参与肝脏炎症反应、肝细胞再生和凋亡等病理生理过程[5]。酒精引起的肝损伤可产生大量的ROS,同时会使内毒素水平升高,炎症介质释放,这些物质都可以使 NF-κB活化,进而产生大量炎性介质,发挥炎性级联放大作用,加重肝脏损害。本实验的结果表明,与正常组相比,急性酒精性肝损伤大鼠肝组织 NF-κB的表达明显增强。

TNF-α是最关键的促炎介质,对NF-κB的活化起正反馈调节作用,它既是 NF-κB的激活物,也是其激活后的产物。TNF-α主要由肝实质细胞和肝内Kupffer细胞分泌产生,低浓度的TNF-α是肝细胞生长分化与再生所必需的调节因子,但高浓度的TNF-α既可以诱导肝细胞凋亡,也可以导致肝细胞坏死,是造成肝细胞损伤的主要因子[6]。越来越多的证据表明,TNF-α是酒精性肝损伤发生的关键细胞因子。TNF-α不仅与 ROS中间体及内毒素血症形成正反馈,同时还可激活细胞因子级联反应刺激其他炎症因子如 IL-1、IL-8等的产生,诱导肝细胞凋亡。本实验的结果表明,与正常组相比,急性酒精性肝损伤大鼠血清 TNF-α含量明显升高,引起炎性损伤。

NAC是一种含巯基的抗氧化剂,对NF-κB的活化和TNF-α的释放有明显的抑制作用。其可能的机制是:①NAC在体内脱乙酰基后生成的半胱氨酸是合成 GSH的前体,可以促进 GSH的合成,提高组织内 GSH含量,防止或调整氧化还原失平衡,抑制酒精引起的细胞氧化应激产生活性氧及其衍生物对IκB激酶的激活,从而抑制 NF-κB核易位和TNF-α mRNA的转录。②NAC是一种极好的巯基供体,可提供大量巯基。现已证实,巯基不仅具有抗氧化作用,更为重要的是可调控 TNF-α等多种基因转录表达[7],这也是 NAC防治酒精性肝损伤发生的分子机制之一。本实验的结果表明,与模型组相比,应用乙酰半胱氨酸后,各剂量组肝脏组织中 NF-κB的表达明显降低,TNF-α含量明显减少,且呈一定的剂量反应关系。

综上所述,乙酰半胱氨酸可以通过抑制 NF-κB的激活,减少炎症因子的释放,发挥抗炎及抗凋亡作用,从而有效防治酒精诱导的肝脏损伤,且其疗效随剂量的增加而加强。

[1] 魏琳琳,陈煜,郑素军,等.N-乙酰半胱氨酸对C3A永生化肝细胞增殖和生物转化功能的影响[J].肝脏,2008,13(1):27-29.

[2] 苏俊,廖彩仙,周杰,等.酒精性肝病 105例临床分析[J].实用医学杂志,2007,23(5):704-705.

[3] 王春妍,范玉强,迟宝荣,等.核因子-κB及其下游因子 TNF-α、Bcl-2在急性肝损伤中的作用及机制[J].世界华人消化杂志,2008,16(25):2804-2808.

[4] Takahiro W,Hirofumi J,Jiahuai H,etal.Synergistic activation of NF-κBby nontypeable haemophilusinfluenzae and tumor necrosis factor-α[J].PNAS,2004,101(10):3563-3568.

[5] Altavilla D,Saitta A,Squadrito G,etal.Evidence for a role of nuclear factor-kappa B in acute hypovolemic hemorrhagic shock[J].Surgery,2002,131(1):50-58.

[6] 李海燕,李夏,金向群,等.黄芩苷对大鼠慢性酒精性肝损伤的影响[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(6):58-60.

[7] De Flora S,Izzotti A,D'Agostini F,etal.Mechanism of N-acetylcysteine in the prevention of DNA damageand cancer,with special reference to smoking-related end-points[J].Carcinogenesis,2001,22(7):999-1013.