复合发酵棉籽粕营养价值及活性产物分析研究

夏新成 张卫辉 刘丽华 滕安国 陈 佳 高 峰 周光宏

(南京农业大学动物科技学院,南京 210095)

复合发酵棉籽粕营养价值及活性产物分析研究

夏新成 张卫辉 刘丽华 滕安国 陈 佳 高 峰 周光宏

(南京农业大学动物科技学院,南京 210095)

旨在研究复合固态发酵 (两株酵母和一株霉菌)对棉籽粕脱毒效果及营养价值的影响,同时分析测定发酵底物中的活性产物。结果表明:复合发酵可极显著降低棉籽粕底物游离棉酚含量 (P<0.01),降解率达 71.90%;棉籽粕底物粗蛋白、总氨基酸和必需氨基酸含量分别提高 28.96%、8.83%、7.58%;发酵 54～60 h时底物中蛋白酶活力最高 (酸性蛋白酶活力为 931.58 U/g,中性蛋白酶活力为 1 097.79 U/g,碱性蛋白酶活力为 798.62 U/g),纤维素酶活力最高 (滤纸酶活力为 1 601.66 U/g,Cx酶活力为 3 590.02 U/g,C1酶活力为1 685.35 U/g),淀粉酶活力最高为 578.05 U/g;同时发酵过程产生了一定量的有机酸。

橄榄假丝酵母 稻根霉 lindneri 固态发酵 棉籽粕 营养价值 活性产物

我国饲料资源不足,特别是蛋白质饲料资源严重匮乏已成为影响我国畜牧业持续发展的主要因素之一。世界各国科技工作者对研究和开发新型蛋白质饲料资源来替代鱼粉、豆粕给予了广泛的关注。作为重要的植物蛋白质饲料资源——棉籽饼粕,由于存在棉酚,氨基酸含量低且不平衡,粗纤维含量高等因素限制了其在养殖业中的大量使用[1-2]。吴小月等[3]选用了不同微生物菌种发酵棉籽饼粕,结果表明:不同微生物菌种脱毒效果有明显差异,其中N25菌种脱毒效果最佳,达 96.9%;发酵脱毒棉仁饼粕肉仔鸡饲养试验亦取得了较好的经济效益。施安辉等[4]报道高效降解棉酚菌株的脱毒率可达82.2%,棉籽粕经微生物脱毒后各种氨基酸含量明显提高。Zhang等[5]研究表明经微生物发酵后,棉籽粕中游离棉酚 (free gossypol,FG)含量显著降低 (P<0.05),粗蛋白 (crude protein,CP)含量、总氨基酸含量和必需氨基酸含量显著提高 (P<0.05)。目前研究主要是高效脱毒菌株的筛选及其脱毒效果和 CP、氨基酸含量变化等,但对发酵棉籽粕营养价值变化和发酵活性产物产生情况等尚缺乏全面评价。较为深入研究经微生物处理前后棉籽粕营养成分变化及蛋白酶、纤维素酶、有机酸等活性物质产生情况,为棉籽粕资源的充分利用提供有力的理论支持和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与菌种

棉籽粕:韩友饲料有限公司,粉碎,过 60目筛,其 FG含量为 728.27 mg/kg,粗蛋白含量为39.05%。

两株酵母菌和一株霉菌:自制筛选,分别为酵母菌目酵母菌科假丝酵母属橄榄假丝酵母 (Candida oleophila)、毛霉菌目毛霉菌科根霉菌属稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、酵母菌目酵母菌科克勒克酵母属lindneri(Kloeckera lindneri[5])。

1.1.2 培养基与发酵底物制备

斜面培养基:马铃薯琼脂培养基,取去皮马铃薯200 g,切成小块,加水 1 000 mL煮沸 30 min。滤去马铃薯块,将滤液补足至 1 000 mL,加葡萄糖 20 g,琼脂15 g,加热煮沸溶化后分装至试管中,量为试管的 1/3,121℃灭菌 30 min。待压力表指针至 0 h时取出,放到一定倾斜度的平面上,使培养基占试管的 2/3,室温下待培养基凝固后,放入培养箱30℃下 2～3 d,检验灭菌是否完全后,可在无菌室中接种培养。

查氏培养基:蔗糖 (30 g)、NaNO3(2 g)、KCl(0.50 g)、FeSO4(0.01 g)、MgS O4·7H2O(0.50 g),K2HPO4(1.00 g)、H2O(1 000 mL)、琼脂 (17 g)。自然pH,121℃灭菌 30 min。

将粉碎过筛后的棉籽粕、玉米与糖蜜按 7∶2∶1比例混合均匀,添加 3%硫酸铵构成基础底物。发酵时按底物与水为 1∶0.6比例加入水,121℃灭菌 30 min。

1.1.3 菌种制备

酵母菌液体菌种的制备:从斜面保存菌种上挑取一环菌苔接入 5 mL马铃薯液体培养基,在试管中30℃,150 r/min摇动培养 48 h(一级菌种),取1.0 mL一级菌种接入 20 mL马铃薯液体培养基在100 mL三角瓶中 30℃,150 r/min摇动培养 48 h(二级菌种)。

黑曲霉孢子悬液制备:从斜面保存菌种上挑取一环菌苔接入 5 mL查氏液体培养基,在试管中30℃,150 r/min摇动培养 48 h(一级菌种),取1.0 mL一级菌种接入 20 mL查氏液体培养基在100 mL三角瓶中 30℃,150 r/min摇动培养 48 h(二级菌种)。

1.1.4 试剂及仪器

结晶酚、羧甲基纤维素钠、3,5-二硝基水杨酸:化学纯,国药集团化学试剂有限公司;kjelatecT M 2300蛋白质自动分析仪:FOSS公司产品;GC-14B气相色谱仪:日本岛津公司;淀粉酶 (AMS)测定试剂盒、乳酸测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法与指标测定

1.2.1 发酵培养

将三菌株分别制备为二级菌种,接入 100 g到棉籽粕发酵底物,接种量为 5%,接种比例为 3∶3∶2,30℃固态发酵培养 90 h,设三个重复。

1.2.2 FG含量的测定

参照国标 GB13086-1991[6]进行测定。

1.2.3 常规养分含量分析

CP、粗脂肪及粗纤维等养分的测定参照文献[7]的相关方法进行测定。

1.2.4 还原糖含量的测定

采用 DNS法[8]进行测定。

1.2.5 氨基酸含量的测定

采用L-8900型日立氨基酸自动分析仪测定[9]。

1.2.6 淀粉酶活力、蛋白酶活力、纤维素酶活力的测定

棉籽粕发酵底物接种后于 30℃下恒温静置培养 ,发酵过程中分别于 12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90 h取样 ,监测发酵过程中酶活力的变化情况。淀粉酶活力测定采用淀粉酶 (AMS)测定试剂盒 (碘 -淀粉比色法);蛋白酶酶酶活力测定采用中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定方法ZBX66030-1987。纤维素酶酶活力测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色法[10]。

1.2.7 有机酸含量测定[11-12]

采用气相色谱分析及乳酸测定试剂盒测定。

1.3 数据统计分析

应用 Office EXCEL整理处理及 SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析及显著性检验。

2 结果与分析

2.1 高温及复合发酵对棉籽粕底物 FG含量及 CP等养分含量的影响

高温及复合发酵对棉籽粕底物 FG含量及 CP等养分含量的影响见表 1。结果表明高温处理显著降低棉籽粕底物中 FG含量,FG降解率为 41.81%,粗纤维含量略微降低,CP含量及粗脂肪含量无显著变化。微生物复合发酵后,棉籽粕底物棉酚含量降解率为 71.90%,优于高温处理;同时 CP含量 (提高率为 28.50%)和粗脂肪含量 (提高率为 22.77%)亦显著提高,粗纤维含量显著降低 (降解率为 25.16%)。

表 1 复合发酵对棉籽粕底物 FG含量及 CP等养分含量的影响

2.2 复合发酵对棉籽粕底物还原糖生成量的影响

复合发酵对棉籽粕底物还原糖生成量的影响见图 1。发酵底物中还原糖含量随发酵时间延长亦产生明显变化。发酵前期底物还原糖含量降低,后期呈现上升趋势并逐渐趋于平缓。

图 1 复合发酵对棉籽粕底物还原糖生成量的影响

2.3 复合发酵对棉籽粕底物氨基酸含量的影响

复合发酵对棉籽粕底物氨基酸含量的影响见表2。结果表明,微生物复合发酵后,棉籽粕底物中 AA含量呈增加趋势,EAA含量和 TAA含量提高率分别为 7.58%和 8.83%,其中甘氨酸 (Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸 (Val)含量显著发酵前 (P<0.05),蛋氨酸 (Met)含量极显著高于发酵前 (P<0.01)。

表 2 复合发酵对棉籽粕底物氨基酸含量的影响/%

2.4 复合发酵对棉籽粕底物淀粉酶活力的影响

复合发酵对棉籽粕底物淀粉酶活力的影响见图2。棉籽粕底物经发酵产生淀粉酶,其活力前期随时间延长而逐渐升高,60 h时最高达 578.05 U/g,随后逐渐降低。

图 2 复合发酵对棉籽粕底物淀粉酶活力的影响

2.5 复合发酵对棉籽粕底物蛋白酶产生的影响

复合发酵对棉籽粕底物蛋白酶产生的影响见图3。结果表明,棉籽粕底物发酵过程中产生了蛋白酶,随着时间的延长,其活力亦产生显著变化。发酵前期蛋白酶活力呈现升高趋势,发酵时间达 54 h,蛋白酶活力达到最高 (酸性蛋白酶活力为931.58 U/g,中性蛋白酶活力为 1 097.79 U/g,碱性蛋白酶活力为798.62 U/g),而后逐渐降低。

图 3 复合发酵对棉籽粕底物蛋白酶产生的影响

2.6 复合发酵对棉籽粕底物纤维素酶产生的影响

复合发酵对棉籽粕底物纤维素酶产生的影响见图 4。结果表明棉籽粕底物发酵过程中产生了纤维素酶,其活力随时间呈现显著变化。发酵前期纤维素酶活力逐渐升高,至发酵 54～60 h达最高[滤纸酶活力为 1 601.66 U/g,Cx酶 (葡聚糖内切酶)活力为3 590.02 U/g,C1酶 (葡聚糖外切酶)活力为1 685.35 U/g],随后逐渐降低。

图 4 复合发酵对棉籽粕底物纤维素酶产生的影响

2.7 复合发酵对棉籽粕底物有机酸产生量的影响

复合发酵对棉籽粕底物有机酸产生量的影响见表 3。结果表明,发酵后棉籽粕底物产生少量有机酸,其含量较发酵前又增加趋势。

表 3 复合发酵对棉籽粕底物有机酸产生量的影响 mg/g

3 讨论

3.1 复合发酵对棉籽粕棉酚含量及营养成分的影响

棉籽粕中含有棉酚、粗纤维含量高以及氨基酸含量低且不平衡等因素使其营养价值大打折扣。张文举等[13]报道利用热带假丝酵母 ZD-3和黑曲霉ZD-8对棉籽饼底物进行复合发酵,可极显著降低棉籽饼底物 FG含量,脱毒率为 91.64%;棉籽饼底物CP、总氨基酸、必需氨基酸含量分别提高 27.83%、18.15%、19.18%;提高 CP、总氨基酸及必需氨基酸体外消化率分别为 20.90%,26.16%、24.47%,赖氨酸和蛋氨酸分别增加 20.24%、66.29%。Kornegay等[15]、Wu等[5]和顾赛红等[14]也有相关类似报道。本试验结果显示,发酵前后棉籽粕底物营养成分发生了显著变化:FG降解率为 71.90%;CP、总氨基酸和必需氨基酸含量分别提高 28.96%、8.83%、7.58%,其中蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸含量增加显著 (P<0.05);粗纤维含量降低 25.16%;粗脂肪含量提高 22.77%。Nagalakshmi等[23]研究报道部分棉籽粕中 FG与微生物发酵过程中产生的氨基酸,或与活性蛋白中游离氨基结合为结合棉酚,从而失去活性;发酵处理后底物 CP含量的提高主要是由于微生物生长代谢作用引起。微生物生长代谢过程中,氧化消耗糖类物质,微生物大量生长繁殖,微生物菌体蛋白丰富,增加了 CP的含量[13,24]。

3.2 复合发酵对棉籽粕底物活性产物生成的影响

微生物发酵可产生多种酶类,同一菌种不同菌株分泌的酶的种类和数量是不同的。本研究筛选的菌株底物发酵过程中产生了淀粉酶,后者可将底物淀粉降解为单糖、双糖等,微生物又可利用这些糖类进一步生长繁殖,合成菌体蛋白。发酵过程中前期由于微生物的生长,底物还原糖含量消耗降低;48 h后其含量又呈现上升趋势并逐渐趋于平缓,其原因可能为微生物代谢产生的纤维素酶积累而降解底物中纤维素使得还原糖含量有增加趋势。试验中,底物发酵蛋白酶可将底物中蛋白质降解为小分子蛋白和氨基酸等,有利于一定程度体外预分解饲料中的蛋白质,使氨基酸含量显著提高,从而促进动物对蛋白质的消化吸收利用[16-17]。发酵过程中酶活力变化显著,54 h左右达到最高而后逐渐降低,其原因可能是因为 54 h后菌种产蛋白酶能力相应降低,同时底物中亦可能产生抑制物,反馈抑制了酶的活性。

纤维素酶是一种多组分酶,包括 C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素,Cx酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料,以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力,它反映的是纤维素酶各组分的协同作用,统称为滤纸酶活 (FPA酶)[18]。本研究表明,底物发酵过程中产生纤维素酶,其能够对底物粗纤维作用,从而降低粗纤维含量,提高棉籽粕营养品质[19]。

酵母、霉菌等多种微生物均可发酵产生有机酸,微生物在碳水化合物代谢过程中,有氧降解被中断而积累各种有机酸[20]。研究选用的三株菌发酵产生了少量有机酸。有研究报道饲料中添加有机酸,具有降低动物胃肠道 pH,改善消化道微生物区系,促进矿物质、维生素吸收,提高消化酶活性,抗应激等作用;从而对改善动物生产性能、提高饲料利用率,增强动物的免疫力免疫等方面具有重要作用[21-22]。

4 结论

经微生物发酵后,由于 FG与培养基中氨基酸等物质结合或微生物分泌的酶类分解 FG,使其含量显著降低;同时微生物大量生长繁殖,产生大量菌体蛋白,底物粗蛋白含量显著增加;同时微生物生长代谢产生氨基酸、蛋白酶、纤维素酶、有机酸等多种活性物质,它们在促进消化,提高动物生产性能,提高免疫力等方面发挥着重要作用。

[1]Robinson P H,Getachew G,Peters E J,et al.Influence of va2 riety and storage for up to 22 days on nutrient composition and gossypol level of Pi ma cottonseed(Gossypium spp.)[J].Ani2 mal Feed Science and Technology,2001,91:149-156

[2]Francis G,Makkar H P S,Becker K.Antinutritional factors present in plant-derived alternate fish feed ingredients and their effects in fish[J].Aquaculture,2001,199:197-227

[3]吴小月,陈金湘.利用微生物降解棉仁粕中游离棉酚的研究[J].中国农业科学,1989,22(2):82-86

[4]施安辉,张勇,曲品,等.高校降解棉酚菌株的选育及脱毒条件的研究[J].微生物学报,1998,38(4):318-320

[5]ZhangW J,Xu Z R,Zhao S H,et al.Developmentof a mi2 crobial fermentation process for detoxification of gossypol in cottonseed meal[J].Animal Feed Science and Technology,2007,135:176-186

[6]GB13086-1991,饲料中 FG的测定方法,中华人民共和国国家标准[S]

[7]张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术 [M].北京:中国农业大学出版社,2004:46-70

[8]蒋立科,罗曼.生物化学实验设计与实践 [M].北京:高等教育出版社,2007:193-195

[9]王宝,张金龙,任红波,等.不同氨基酸自动分析仪氨基酸分析结果之比较[J].饲料博览,2005,(9):36-37

[10]赵亚华.生物化学试验技术教程[M].广州:华南理工大学出版社,2005:149-151

[11]孙付保,赵长新.啤酒酵母发酵产有机酸的初步研究[J].食品与生物技术学报,2005,24(5):51-54

[12]綦振起,赵淑福.有机酸分析系统检测有机酸 [J].现代科学仪器,2004(5):50-52

[13]张文举,许梓荣,孙建义,等.假丝酵母 ZD-3与黑曲霉ZD-8复合固体发酵对棉籽饼脱毒及营养价值的影响研究[J].中国粮油学报,2006,21(6):129-135

[14]顾赛红,孙建义,李卫芬.曲霉 PES固体发酵对棉籽粕营养价值的影响[J].中国粮油学报,2003,18(1):70-73

[15]Kornegay E T,Kelly R F.Fungal-treated Conttonseed Meal for Swine[J].J Nutrition,1972,102:1471-1476

[16]唐胜球,董小英,邹晓庭.饲用酸性蛋白酶研究及其应用[J].饲料广角,2003(2):19-22

[17]王文娟,宋俊梅,曲静然.黑曲霉发酵豆粕产蛋白酶活性的研究[J].中国酿造,2007(5):23-26

[18]汪金萍.单菌株发酵和混合菌株发酵产纤维素酶的研究[D].南昌:南昌大学,2007

[19]刘成,孙中涛,田林茂.黑曲霉产木聚糖酶固态发酵条件及部分酶学性质的研究[J].生物技术,2007,17(4):82-85

[20]尹光琳,战立克,赵根楠,等.发酵工业全书 [M].北京:中国医药科技出版社,1992:342-345

[21]Zdzislaw M.OrganicAcids as PotentialAlternatives toAnti2 biotic Growth Promoters for Pigs[J].Advances in Pork Pro2 duction,2005,16:169-182

[22]Biagi G,Piva A,MoschiniM,et al.Roth.Effect of glu2 conic acid on piglet growth performance,intestinal microflo2 ra,and intestinal wall morphology[J].Animal Science,2006,84:370-378

[23]Nagalakshmi D,Sastry V R B,Pawde A,et al.Rumen Fer mentation Patterns and Nutrient Digestion in Lambs Fed CottonseedMeal Supp lementalDiets[J].Animal Feed Sci2 ence and Technology,2003,103:1-4

[24]杨继良,周大云,杨伟华,等.高效降解棉酚菌种的筛选及棉饼脱毒参数的研究[J].棉花学报,2000,12(5):225-229.

NutritionalValue and Active Products of Compound Fer mented CottonseedMeal

Xia Xincheng ZhangWeihui Liu Lihua Teng Anguo Chen Jia Gao Feng Zhou Guanghong
(College ofAnimal Science and Technology,NanjingAgricultural university,Nanjing 210095)

The effect of mixed culture solid fermentation on detoxification and nutritional value of cottonseed mealwas investigated.Cottonseed meal was fer mented with three strains(Rhizopus oryzae,Candida oleophila and Kloeckera lindneri),then the reducing sugar content,protease activity,cellulase activity,amylase activity and organic acid content of the fermented cottenseed meal were analyzed,and its free gossypol(FG)content,crude protein(CP)content and amino acid contents were also determined.Results:The mixed culture fer mentation significantly(P<0.01)decreases FG content in the fermented cottonseed meal,making a detoxification rate up to 71.90%.The CP content,total amino acids and essential amino acids are increased by 28.50%,8.83%,7.58%,respectively.The protease activities of the cottenseed meal after 54～60h fermentation are enhanced to peak values,namely,acid proteinase activity 931.58 U/g,neutralproteinase activity 1097.79 U/g,and alkaline protease activity 798.62 U/g;the cellulase activities are also enhanced to peak values,such as filter paper activity(FPA)1601.66 U/g,Cx en2 zyme activity 3590.02 U/g,and C1 enzyme activity 1685.35 U/g.The amylase activity of the fermented cottenseed meal is enhanced to a peak value of 578.05 U/g.Meanwhile,a certain amount of organic acids are produced in the fer mentation.

Candida oleophila,Rhizopus oryzae,lindneri,solid-state fermentation,cottonseed meal,nutri2 tional value,active products

S816.6

A

1003-0174(2010)02-0096-05

2009-02-19

夏新成,男,1984年出生,硕士,动物营养与饲料科学

高峰,男,1970年出生,教授,动物营养生理