P38 信号通路在Aβ 介导的PC12 细胞损伤中的作用

徐 芳 魏桂荣

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是较常见的神经系统变性疾病,表现为进行性认知功能障碍。AD 的病因尚未阐明,其病理学特征之一为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积。Aβ 由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经剪切而成,主要包括Aβ1-40 和Aβ1-42。目前认为,Aβ 对神经元具有损伤作用,其主要作用的物质为可溶性的Aβ 寡聚体[1],但Aβ 引起神经元损伤的机制尚不明确。P38信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族重要组成部分,在全身性炎症反应、休克、细胞迁移、细胞凋亡、心血管疾病等方面具有重要作用,研究发现P38 信号通路参与某些神经系统变性疾病的发病过程[2],但是其在AD 发病过程中的作用尚不清楚,本研究使用Aβ 处理PC12 细胞,建立体外AD 细胞模型,并在此模型基础上观察了P38 信号通路在Aβ 介导的细胞损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和实验试剂 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞株由武汉大学典型培养物储藏中心提供;DM EM 培养基购于美国GIBCO 公司;二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(M TT )、Aβ25-35 和SB203580 购自美国Sigma 公司;兔抗P38 抗体和磷酸化P38(pP38)抗体购自Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和Aβ 处理 PC12 细胞用DM EM 的培养基(含10%的小牛血清,2 mmol/ L L-谷氨酰胺),37 ℃5%CO2培养箱中培养,每隔48 h 传代1 次,待细胞铺满80%左右传代。实验中使用不同浓度的Aβ(浓度为10 ～30 mmol/L)处理PC12 细胞。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝法(M T T)检测细胞活力调整PC12 细胞密度约2x105/ml,每孔100 μl 接种到96 孔板中,在37 ℃5%CO2培养箱中培养过夜,分为对照组、Aβ 组和SB203580 预处理组,每组设4个复 孔, Aβ 组以不 同 浓 度的 Aβ25-35 处理,SB203580 预处理组在Aβ 处理前30 min 给予SB203580(20 μmol/L)。各组达到处理时间后每孔加M TT 10 μl,继续孵育4 h,吸取培养基,每孔加100 μl DM SO,震荡10 min,酶标仪选用单吸收波长570 nm 检测各孔光吸收值(A 值)。细胞存活率的计算公式为细胞存活率=实验组A 值/对照组A值×100%。

1.2.3 免疫印迹法(Western blotting)检测P38 通路活化 实验设对照组、Aβ 组和SB203580 预处理组,SB203580 预处理组在Aβ 处理前30 min 给予SB203580(20 μmol/L);细胞处理后吸弃培养基,生理盐水洗3 次, 转移离心管中,800 r/min 离心5 min,同样方法洗3 次,弃上液,加4x SDS 上样缓冲液,沸水中水浴5 min,测蛋白浓度。20 μg 蛋白样品用10%SDS-PAGE 分离后,350 mA 恒流湿法电转移1 h 至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别用小鼠抗P38 和p-P38 抗体4 ℃孵育过夜,TBST 洗3 次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗室温孵育1 h,洗膜,化学发光,显影,扫描,用总ERK1/2 蛋白条带作参照, 凝胶分析系统分析P38 和p-P38 条带灰度比值变化。

2 结 果

2.1 Aβ 对PC12 细胞活力的影响

随Aβ 浓度的增高,细胞活力逐渐下降(图1)。10 mmol/L 、20 mmol/L 和30 mmol/L Aβ25-35 处理后细胞活力分别下降到对照组的(73.21 ±3.65)%、(52.84±4.91)%和(40.38±4.71)%,与对照组比较,P＜0.01。且4 个浓度的Aβ 处理组之间均有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 Aβ 对PC12 细胞P38 通路活化的影响

正常生长的神经元样PC12 细胞中存在P38 表达,但p-P38 表达极少;Aβ 处理后P38 表达量无明显变化,但是p-P38 随着Aβ25-35 处理事件的延长表达量逐渐增高, 以P38 表达为参照, 计算P38 与p-P38 表达量的灰度比值,发现4 h 时p-P38 表达开始升高,12 h 达到高峰,并一直持续到24 h(图2)。

图1 Aβ 对PC12 细胞活力的影响与对照组比较, * P ＜0.05

图2 Aβ 和SB203580 对P38 通路活化的影响

2.3 SB203580 对Aβ 诱导的PC12 细胞活力下降和P38 通路的影响

SB203580 预处理能够明显抑制P38 通路的活化(图2)。在20 umol/L 的浓度下SB203580 单独处理对细胞活力没有明显影响,而SB203580 预处理能够明显减低Aβ 介导的细胞活力下降,细胞活力由(52.84±4.91)%上升到(75.32±5.23)%,与单独Aβ 处理组比较,P＜0.05(图3)。

图3 Aβ 和SB203580 对PC12 细胞活化的影响与对照组比较, *P ＜0.05;与Aβ 组比较, #P ＜0.05

3 讨 论

AD 是临床上常见的神经系统变性病,其发病机制存在许多学说。AD 的神经病理学特点为受损神经元内Aβ 异常聚集,而Aβ 是淀粉样前体蛋白(APP)的异常酶切产物,而APP 基因突变也可导致AD 的发生,因此Aβ 毒性是AD 发病的一个重要机制[3]。既往研究发现,Aβ 立体定位脑室内注射能够诱导动物出现痴呆[4]。但是,Aβ 导致神经元损伤的确切机制尚不明确。本研究选择PC12 为研究对象,PC12 细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,能够较好地模拟神经元的某些特征,因此常用于神经系统变性疾病发病机制的研究,结果发现Aβ 能剂量依赖性的诱导PC12 细胞活力下降。因此本研究采用该模型进行Aβ 诱导细胞凋亡机制的研究。

P38 信号通路是细胞内重要的信号通路,从属于MAPK 信号通路。某些刺激因素通过一系列酶促级联反应激活MKKKK3 和M KK6 等分子,进一步磷酸化P38 而激活P38 信号通路,这种级联放大式的激活能够将信号放大,同时还能够在各个环节上调节信号转到过程。受P38 信号通路调控的细胞效应包括细胞凋亡、应激反应、炎症等[5]。既往研究发现P38 信号通路是细胞正常功能所必需的信号通路,但也有研究发现P38 通路参与各种细胞损伤[6]。本研究发现Aβ 处理PC12 细胞后出现P38信号通路活化,而用其特异性抑制剂SB203580 预处理则能够明显抑制Aβ 介导的P38 信号通路活化和细胞损伤,因此说明P38 信号通路可能参与Aβ介导的细胞损伤。

P38 诱导细胞损伤的确切机制尚不清楚,但既往研究发现许多细胞损伤因素如紫外线、高渗环境、细胞因子等都能够激活P38 信号通路,P38 通过激活c-jun、c-fos,诱导Bax 转位等机制进一步导致细胞损伤。另外,P38 通路参与细胞周期和细胞骨架调节,而细胞周期和细胞骨架异常也是AD 发病的重要环节[7]。

综上所述,本研究发现P38 信号通路参与Aβ诱导的PC12 细胞损伤,抑制P38 信号通路可能具有神经保护作用。

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