颅内动脉粥样硬化斑块内核转录因子与白介素-1β的表达与斑块稳定性的相关研究

肖 玲 李汇源 林亚新 吕 健

动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见病、多发病,是脑卒中和心肌梗死等疾病发病的共同基础,随着人们生活水平的提高,其发病有逐年提升的趋势。

本实验拟通过免疫组化的方法观察NF-kB/p65 和IL-1β 在人颅内动脉粥样硬化斑块中的表达特点,并分析其与斑块稳定性的关系,为不稳定性斑块的早期防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 尸检或尸库内脑梗死患者梗死部位动脉,患者死后24 h 内剖检,并立即用10%中性福尔马林固定,然后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋。HE 染色后在光镜下将斑块组织分为不稳定性斑块组、稳定性斑块组和正常血管组各20 例。

1.2 主要试剂 一抗:兔抗人NF-kB/p65(多克隆抗体购自Commical 公司,工作浓度1∶800);一抗:兔抗人IL-1β(购自北京中杉公司,单克隆抗体,工作浓度为1∶100);兔两步法检测试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自北京中杉公司。

1.3 HE 染色 石蜡切片脱蜡至水,水洗后苏木素浸染5 min,1%盐酸乙醇溶液分化,1%氨水返蓝,伊红浸染5 min,上行梯度酒精脱水,二甲苯透明后中性树胶封片。光学显微镜下观察、分组。

1.4 免疫组织化学染色 实验按产品说明书操作,石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O2孵育10 min, PBS浸洗3 min×2 次,高压加热抗原修复2 min,自然冷却后PBS 浸洗5 min×3 次,分别滴加一抗NF-kB/p65(1∶800)、IL-1β(1∶100);4 ℃冰箱过夜;PBS 浸洗5 min×3 次;滴加二抗,孵育30 min,PBS 浸洗5 min×3 次,DAB 显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。

1.5 斑块稳定性的判定标准 根据光镜及图像分析测定,按国际上通用的标准,将脂质核心大于斑块面积40%的斑块定义为不稳定斑块,而脂质核心小于斑块面积40%的斑块定义为稳定斑块。选取稳定和不稳定斑块各20 块及正常血管20 块进行免疫组织化学染色。

光镜下观察免疫病理切片,以细胞胞质内出现棕黄色颗粒为染色阳性。不稳定性斑块组、稳定性斑块组和正常血管每张切片分别随机选取5 个高倍视野,采用HPIAS 图像分析系统对图像分析处理,在10×40 放大倍数下评估阳性细胞所占视野的百分比。

1.6 统计学处理 全部数据采用SPSS13.0 软件,组间比较用卡方检验,P＜0.001为有统计学意义;二者的表达相关性采用直线相关分析。

表1 3 组阳性细胞占视野百分比(%)

图1 IL-1β 与NF-kB/p65 表达的相关性

2 结 果

2.1 NF-kB/p65 在动脉粥样硬化斑块中心、血管平滑肌细胞以及炎细胞内均有表达;IL-1β 在血管内皮细胞及增生的平滑肌细胞中表达较多。NFkB/p65、IL-1β 在不稳定斑块组中的表达较在稳定性斑块组中明显增加(图2 ～5),且二者均较正常血管表达增加,其差异具有统计学意义(P＜0.001)。

2.2 IL-1β 与NF-kB/p65 表达的相关性 直线相关分析显示,IL-1β 与NF-kB/p65 在AS 斑块中的表达呈明显正相关(r=0.796,P＜0.001)。

图2 NF-kB/p65 在不稳定性斑块的表达

图3 NF-kB/p65 在稳定性斑块的表达

图4 IL-1β 在不稳定性斑块的表达

图5 IL-1β 在稳定性斑块的表达

3 讨 论

近年来,越来越多的证据显示对于急性脑缺血性疾病的发生,动脉粥样硬化斑块是最危险的因素。许多基础和临床研究发现,脑梗死均伴发炎症反应,此反应是由多种细胞因子介导的一种链锁过程[1]。

白细胞介素-1 被认为是一种具有多种生物学效应的细胞因子,它们可介导缺血性脑损伤。IL-1家族成员有3 个:IL-1α、IL-1β 和IL-1ra。白细胞介素1β(IL-1β)是一种参与动脉粥样硬化斑块形成的细胞因子,可由动脉壁内皮细胞、SM C 产生[2],而且IL-1β 的水平远高于IL-1α。

IL-1β 可诱导内皮细胞表达多种粘附分子及趋化因子[3～5],使血管通透性增加以及产生有细胞毒性的脂质过氧化物;可刺激血管内皮细胞增殖,提高凝血酶原活性,促进中性粒细胞对血管壁的粘附及平滑肌细胞增生,外周血单核细胞迁入内皮下间隙被激活并分化为巨噬细胞,进而摄取脂质形成泡沫细胞,从而促进动脉粥样硬化的发生和发展。

越来越多的研究表明,IL-1 的生物学效应主要由NF-kB 调控[6]。因此,阐明IL-1 活化NF-kB 的机制显得尤为重要。

NF-kB 是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子,它与抑制性蛋白ikb 结合,呈无活性状态(nf-kb-ikb 复合物),由两个亚基组成p65p50。它可以被许多刺激剂激活,如细胞因子、氧化剂、病毒及细胞脂多糖等。激活的核因子-kb 与ikb 解离,p65p50 就快速易位入胞核,与靶基因启动子处的kb 位点结合,调控IL-1 等基因的转录和翻译。NFkB 可在转录水平调节细胞因子(如IL-1)表达;IL-1又可再进一步激活核因子kB,如此循环,产生级联放大作用,从而加剧炎症反应[7]。激活放大的核转录因子从细胞浆移位到细胞核内,导致基质蛋白酶转录增强,导致基底膜基质的分解,纤维帽变薄,也意味着斑块稳定性降低。IL-1 是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。

斑块的脂质中心越大,纤维帽越薄,则斑块越容易破裂导致血栓形成[8]。通过本实验我们发现正常血管组未见动脉粥样硬化斑块形成;稳定斑块组则见脂质核心很小或无,斑块由大量胶原组成,胶原纤维内平滑肌细胞较多,淋巴样细胞和巨噬细胞很少;不稳定斑块组内斑块为偏心性斑块,含有大的脂质坏死核心,纤维帽很薄,有的斑块内可见出血,纤维帽内见较多淋巴样细胞和巨噬细胞浸润,平滑肌细胞很少,尤其在纤维帽的肩部。

本实验结果显示,在动脉粥样硬化斑块的肩部(动脉粥样硬化斑块与正常内膜交界处)、脂核周围的泡沫细胞和巨噬细胞内及中膜平滑肌细胞内可见IL-1β 及N F-kB/p65 表达,且在斑块内的表达要显著高于正常血管,表明IL-1β 及NF-kB/p65 在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用。同时对三组的表达进行统计学分析发现二者在不稳定性斑块组的表达要高于稳定性斑块组,由此本研究推断二者可能降低斑块的稳定性。本实验做N F-kB 和IL-1β的直线相关显示,两者的表达呈明显正相关(r=0.796,P＜0.001),因此可以说,NF-kB 可能促进了IL-1β 的表达及活性的增强。

本实验结果表明IL-1β、NF-kB/p65 是促进动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素,拮抗或抑制IL-1β 及NF-kB/p65 表达将成为稳定性斑块的治疗方向或靶点之一,但由于斑块的发生、发展和破裂与多种因素相关,对此尚需进一步深入研究。

1 周学平.低分子肝素治疗急性脑梗死的临床研究.临床和实验医学杂志,2006,5(4):354-354.

2 Moyer CF, Sajuthi D, Tulli H , et al.Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis.Am J Pathol,1991,138(4):951-960.

3 Sironi M, Sciacca F L, M atteucci C, et al.Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13:selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production.Blood, 1994, 84(6):1913-1921.

4 Wang X, Giora ZF, Gu JL, et al.Interleukin-1β induceex pression of adhesion m olecules in human vascular smooth muscle cells and enhances adhesion of leukocy te to sm ooth muscle cells.A therosclerosis, 1995, 115(1):89-98.

5 孟 峰,邓仲端.白细胞介素-1 肿瘤坏死因子和脂多糖对人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1 的影响.中华病理学杂志,2000,29(1):46-48.

6 Lee JI, Burckart GJ.Nuclear factor Kappa B:im portant transcription factor and therapeutic larget.J Clin Pharmacal, 1998,38(11):981-993.

7 Bourcier T , Sukhona G, Libby P.The nuclear factor-kB signaling pathw ay participates in dysregulation of vascular smooth muscle cells in vitro and in human atherosclerosis.J Biol C hem ,1997, 272(15):817-824.

8 Yuan C, Zhang SX, Polissar NL, et al.Identification of fibrous cap rupture w ith m agnetic resonance imaging is highly associated w ith recent transient ischemic attack or stroke.Circulation,2002, 105(2):181-185.