葛根素对脑缺血再灌注大鼠脑组织eNOS蛋白表达的影响

谷翠芝 卢慧玲 吴秋慧 杨峻浩 冯飞玲 张均智 农琳琳

葛根素是从本国传统中药葛根中提取的有效成分,能够改善微循环,临床上常用于治疗心脑血管疾病,但其具体作用机制迄今仍未完全清楚。脑缺血再灌注损伤是影响缺血性脑血管病预后的重要因素之一,它主要由自由基生成、钙超载和白细胞激活而引发。最近研究认为,神经元似乎对一氧化氮(nitric oxide, NO)自由基的毒性作用更敏感。已有研究发现,葛根素能下调脑缺血再灌注后脑组织诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的表达或活性,它是否也通过影响脑组织内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表达而发挥脑保护作用?目前尚未见相关报道。本研究采用多种实验方法,探讨葛根素对脑缺血再灌注损伤的保护作用与脑组织eNOS 蛋白表达的关系,为临床应用葛根素防治缺血性脑血管病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制作 健康雄性SD 大鼠45只,体重(322±39)g ,由桂林医学院动物中心提供,SPF 级,并随机分为假手术组(S 组)、对照组(M组)、治疗组(P 组),每组各15 只。采用线栓法栓塞大鼠左侧大脑中动脉造成局灶性脑缺血,其中M 组和P 组脑缺血2 h 后退出线栓再灌注24 h,S 组仅分离血管,不插线;P 组分别在脑缺血即刻和再灌注2 h 腹腔注射葛根素60 mg/kg , S 组和M 组在同样时间点注射等量生理盐水。

1.2 药品和试剂 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazoliurn chloride, T TC)购于南京建成生物有限公司;注射用葛根素购于山东瑞阳制药有限公司;兔抗eNOS 多克隆抗体(一抗)、SABC试剂盒、DA B 显色试剂盒(黄)和复合消化液均购于武汉博士德生物技术公司。

1.3 观察指标及其测定方法

1.3.1 神经功能缺损评分(5 分法) 脑缺血2 h和再灌注24 h 按照Longa 5 分法评分标准对各组大鼠进行神经功能缺损评分,即0 分:无神经功能缺损;1 分:提尾时右前肢内收,不能完全伸展;2 分:自发行走时向右侧转圈;3 分:行走时身体向右侧倾倒;4 分:不能自发行走;5 分:有意识丧失。评1 分及以上者定为造模成功。

1.3.2 脑梗死面积测定 每组随机选取5 只大鼠断头取脑,立即将大脑冷冻30 min(-20 ℃),取出在距额极2 mm 处向后连续等距切取5 个冠状位脑片,间距为2 mm,置2%TTC 生理盐水中37 ℃避光水浴30 min,再用中性甲醛固定2 h,数码相机照相。梗死脑组织为白色,正常脑组织为玫瑰红色。用Image pro-plus 图像分析系统计算每个样本五个脑片的总面积和梗死灶面积的百分比。

1.3.3 脑含水量测定 每组随机选取5 只大鼠断头取脑,称量两侧半脑湿重。将大脑置干燥箱中,100 ℃烘烤24 h 至恒重,称量干重,计算含水量。脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.4 免疫组化DAB 染色法测定脑组织eNOS 蛋白表达及分布 每组随机选取5 只大鼠断头取脑,将大脑呈冠状位切成5 片,依次用中性甲醛固定,循序脱水、浸蜡、包埋。取视交叉处脑片蜡块切片,采用酶消化法修复抗原, 正常山羊血清封闭, 兔抗eNOS 多克隆抗体孵育(1∶100),DAB 显色,棕黄色或橙黄色为eNOS 蛋白表达阳性。400 倍光镜下观察并照相,每张切片随机记录5 个视野,用Image pro-plus 图像分析系统计算各样本平均光密度。

1.4 统计学处理 采用SPSS12.0 统计软件包。神经功能缺损评分为等级资料,采用非参数检验中的Kruskal-Wallis 检验和两个独立样本等级资料的检验。其他资料均为计量资料, 采用One Way ANOV A 分析,组间两两比较采用LSD-t 法, 结果用均数±标准差(±s)表示。均以α=0.05(tw otailed)作为检验水准,P＜0.05为差异有显著意义。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分 在脑缺血2 h 和再灌注24 h S 组大鼠均未出现神经功能缺损表现,M 组神经功能缺损表现均较重,而P 组明显减轻,组间比较,P＜0.05或P＜0.01,见表1。2.2 脑梗死面积 S 组未见梗死灶;M 组出现大面积梗死灶,梗死范围涉及皮质、皮质下区、纹状体及海马,脑梗死面积明显高于P组(P＜0.01),见表2。

表1 葛根素对大鼠脑缺血2 h 和再灌注24 h 神经功能缺损评分的影响

表2 葛根素对脑缺血2 h 和再灌注24 h 大鼠脑梗死面积、脑含水量和脑组织eNOS 蛋白表达的影响(±s)

表2 葛根素对脑缺血2 h 和再灌注24 h 大鼠脑梗死面积、脑含水量和脑组织eNOS 蛋白表达的影响(±s)

注:与S 组比较, #P ＜0.01, 与M 组比较, △P ＜0.05, *P ＜0.01

组别 例数 脑梗死面积百分比(%)脑含水量百分比(%)eNOS 平均光密度S 组 5 0.00±0.00 73.69±0.12 0.162 8±0.015 7 M 组 5 34.67±8.56# 78.82±0.13# 0.383 7±0.039 0#P 组 5 17.74±6.43* 75.64±1.15* 0.255 4±0.066 1△

2.3 脑含水量 脑缺血2 h 再灌注24 h 取脑,可见S 组大脑左右两侧对称,未见水肿及苍白区;M组左脑明显大于右脑,左脑水肿,其顶叶皮质可见苍白区;P 组大脑基本对称,未见明显水肿和苍白区。M 组明显高于S 组和P 组(P＜0.01)(表2)。

2.4 脑组织eNOS 蛋白表达和分布 eNOS 蛋白主要表达在血管内皮及中、小血管平滑肌细胞胞膜上,部分神经细胞胞膜也有表达。S 组大血管内皮及脉络丛有少量表达,海马及皮层微血管和毛细血管内皮表达不明显;M 组和P 组大鼠缺血区的周围组织eNOS 表达明显增强,以中小血管、微血管及毛细血管为主。M 组eNOS 阳性表达水平显著高于S组和P 组(P＜0.05或P＜0.01)(表2)。

3 讨 论

再灌注损伤是在缺血性脑损伤的基础上发展而来的,其确切的发生机制尚不完全清楚。目前认为它的发生主要与自由基生成、钙超载和白细胞激活有关。最近研究认为,神经元、胰腺细胞、巨噬细胞似乎对NO 自由基的毒性作用更敏感。NO 是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)作用下生成。NO 在缺血性脑损伤中具有损伤和保护双重作用,其具体作用与NOS 类型、NO浓度和组织损伤的演化阶段密切相关。NOS 依据组织类型可分为三种:nNOS、eNOS 和iNOS。正常情况下Ca2+经N-甲基-D-天(门)冬氨酸受体内流诱导钙调蛋白(钙依赖酶),调控存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞的eNOS,控制生成微量的NO,主要舒张血管平滑肌,调节脑血流量,抗血小板聚集和白细胞粘附[1];神经元中的nNOS 也能合成微量NO,维持神经冲动的传递;iNOS 正常情况下不表达。在脑组织中低浓度的NO 对谷氨酸的释放有抑制作用,而高浓度的NO 却有促进作用[2]。已有证据表明,局灶性脑缺血再灌注急性期(6 h 内)缺血区周围血管及神经细胞eNOS 表达上调,合成适量NO发挥脑保护作用;在亚急性期(6 ～48 h)除eNOS 表达上调外,iNOS、nNOS 的表达也明显上调[3,4]。脑缺血再灌注刺激脑组织三种NOS 表达均增加,生成过多的NO,高浓度NO 在供氧充分的条件下与氧自由基反应, 生成氧合超氧化氮阴离子(ONOO-)和羟自由基,直接氧化巯基化合物、脂类和蛋白质等,造成神经细胞损害[1]。这可能是缺血再灌注引起脑损伤的重要机制之一。

本实验在脑缺血和再灌注后应用葛根素,能明显改善大鼠脑缺血再灌注亚急性期的神经功能缺损表现,减轻脑含水量和减少脑梗死面积,这表明葛根素能在亚急性期有效减轻脑缺血再灌注造成的脑损伤。免疫组化结果显示,葛根素减少了亚急性期脑血管内皮细胞和平滑肌细胞eNOS 的表达,这提示它的脑保护作用机制可能与降低脑缺血再灌注亚急性期的eNOS 的表达有关。王资颖等应用经过结构修饰的葛根素——羟乙葛根素降低脑缺血再灌注大鼠亚急性期脑组织 的NO 水平和总NOS、iNOS 的活性[5]。有研究表明,葛根素能提高心肌梗死模型大鼠心肌的eNOSmRNA 表达和正常大鼠心、脑组织中的总NOS 活性[6,7];徐玉娥也发现葛根总黄酮能升高经过运动训练的大鼠的心肌、肝脏和脑组织的活性[8]。由以上研究结果可推测,在机体正常状态下葛根素即可提高eNOS 活性或表达;缺血时葛根素增强eNOS 表达,合成NO 迅速扩张血管,增加组织血流量,防止或减轻组织进一步的损伤级联反应;再灌注后由于葛根素在缺血时产生的保护作用,使神经细胞处于较好的状态,未出现钙超载或钙超载不严重,而未用药的脑缺血再灌注模型大鼠可能出现严重的钙超载;因为eNOS 是钙/钙调蛋白依赖性酶,所以再灌注后出现了M 组脑组织eNOS 蛋白表达反而高于P 组的结果;同时,因组织损伤减轻,iNOS 的活性也降低。两种NOS 活性或表达在缺血再灌注亚急性期均降低,使NO 生成不至于过多,减少了ONOO-和羟自由基形成的可能性,从而进一步减轻再灌注造成的脑损伤。

1 赵建国.脑梗死.第1 版.北京:人民卫生出版社,2006.3-15.

2 孙凤艳.医学神经生物学.上海:上海科学技术出版社,2008.172-173.

3 M oro MA, Gardenas A, H urtado O.Role of nitric oxide after brain ischemia.Cell C alcium, 2004, 36(3-4):265-275.

4 聂莹雪,郭 政,禹红梅.缺血再灌注损伤后nNOS、eNOS 及iNOS 表达的变化.中国血液流变学杂志,2006,16(3):332-340.

5 王姿颖,魏欣冰,孙 茹,等.羟乙葛根素对大鼠脑缺血再灌注损伤一氧化氮和一氧化氮合酶的影响.中国药学杂志,2006,41(2):113-114.

6 张三印, 沈映君.葛根素对心肌梗死大鼠心肌H IF-1、eNOS、VEGF 基因表达及血清NO 浓度的影响.中药药理与临床,2007,23(5):54-57.

7 吴 平,曾繁荣,马厚勋.葛根素对大鼠脑及脏器组织一氧化氮体系的影响及其作用机制的探讨.中国中西医结合杂志,2001, 21(3):196-198.

8 徐玉娥.葛根总黄酮对运动大鼠诱导型一氧化氮合酶的影响.渭南师范学院学报,2003,18(5):68-69,89.