不同浓度β-淀粉样蛋白寡聚体的毒性差异

刘郁东 梁直厚 孙圣刚 乔 娴

阿尔茨海默病(Alzheimer' s disease, AD)是最常见的老年神经退行性疾病, 以记忆和认知功能障碍为主要特征, 在早期尤其以记忆障碍突出。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAM P response element binding protein, C REB)的133 位丝氨酸被蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)等激酶磷酸化形成磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(phosphorylated cAM P response element binding protein,pC REB),进而影响蛋白质的合成在记忆形成中发挥着关键性作用。老年斑是AD 的主要病理改变之一,其核心成分是β 淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的42 肽段形式(Aβ1-42)。Aβ1-42在沉积形成老年斑前的可溶性形式——Aβ1-42寡聚体(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)被认为是AD 早期记忆障碍的触发因素[1],如何拮抗ADDLs 的毒性是研究AD 治疗靶点的热点之一。在ADDLs 的众多机制中ADDLs 所导致的钙紊乱尤其受到关注。胞内钙浓度升高可激活一种蛋白水解酶——钙蛋白酶(calpain), 激活的calpain 可剪切包括影响记忆形成蛋白在内的众多胞内蛋白,导致记忆障碍,如何合理抑制calpain 活性也是研究AD 治疗的热点之一[2]。

脑内ADDLs 负荷水平与AD 的病理分期呈正相关,因此ADDLs 浓度随AD 的进展呈动态变化,不同浓度的ADDLs 可能通过不同的通路发挥其毒性作用[3]。Calpain 的激活是否在不同浓度的ADDLs 的毒性通路中均发挥了作用尚不清楚。研究不同浓度ADDLs 毒性通路的差异对进一步研究如何差异性拮抗ADDLs 的毒性及针对不同时期的AD患者差异性治疗有重要意义。

本研究采用不同浓度的ADDLs 处理PC12 细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)建立AD 细胞模型,通过检测不同浓度ADDLs 作用下calpain 的激活程度, PKA 催化亚基的两个亚型PKA-Cα和PKA-Cβ 及pCREB 的蛋白表达变化来探讨不同浓度ADDLs 毒性机制的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 PC12 细胞 用含10%小牛血清的高糖DM EM 培养液在37 ℃, 5% CO2培养箱内培养PC12 细胞。每周传代1 ～2 次,取生长期细胞用于实验。

1.1.2 试剂Aβ1-42(Bio-Scientific), HFIP(Sigma),小牛血清、DM EM(Gibco),裂解液、BCA 试剂(碧云天公司),forskolin(Alexis),calpain 抑制剂E-64 d(Sigma), calpain 抗体(Sigma), pC REB 抗体(Millipore),β-actin 抗体(Santa Cruz),PKA-Cα抗体(abCam),PKA-Cβ 抗体(Santa Cruz),辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(Pierce)。

参照文献[4]方法配制ADDLs:Aβ1-42粉末2.2 mg 溶于500 μl HFIP 中,置于冰上在氮气通风橱中风干过夜,待HFIP 完全干燥后加入100 μl DMSO制备成5 mmol/L 浓度于-20 ℃冻存备用。临用前用冷DM EM 稀释成100 μmol/L 并置于4 ℃过夜。

1.1.3 仪器 BF-2000 氮气通风橱(北京八方仪器厂), 电泳仪(北京六一仪器厂), 多功能酶标仪(BioTek),凝胶成像系统(北京赛智创业),CO2培养箱(Heal Force)。

1.2 方法

1.2.1 PC12 细胞处理 0.5 μmol/L,1 μmol/L,1.5 μmol/L,2 μmol/L,2.5 μmol/L ,3 μmol/L 的ADDLs 分别处理PC12 细胞3,6, 12,24,36 和48 h。

1.2.2 Western blot 检测μ-calpain 激活程度,PKA-Cα、PKA-Cβ 和pCREB 蛋白表达水平

常规提取蛋白(检测pC REB 时,提取蛋白前10 μmol/L forskolin 预处 理30 min),BCA 法 进行蛋白定量,取约50 ～80μg 蛋白质经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转到NC 膜,室温封闭(5%脱脂奶粉)1 h,加入一抗:小鼠抗单克隆μ-calpain 抗体1∶1000;兔抗多克隆PKA-Cα抗体1∶1000;兔抗多克隆PKA-Cβ 抗 体1 ∶400;小鼠抗pC REB 单克隆抗体抗体1∶1000;小鼠抗单克隆βactin 抗体1 ∶400。4 ℃孵育过夜, TBST 洗膜3次,加入二抗(1∶3000)室温孵育1 h;TBST 洗膜3次,ECL 显色。结果以赛智创业autogel 图像分析软件分析,采用条带密度分析法,calpain 激活程度根据78 kDa 条带与80 kDa 条带的比值衡量,并拍照保存。

2 结 果

与对照组比较,3 和6 h 各浓度处理组均未出现calpain 激活程度和pCREB 水平的差异(P＞0.05);处理12 h 各浓度处理组均出现pCREB 下降(P＜0.05),0.5 μmol/L,1 μmol/L 和1.5 μmol/L 的ADDLs 未能激活calpain(P＞0.05),而2 μmol/L,2.5 μmol/L 和3 μmol/L 的ADDLs 则激活calpain(P＜0.01);calpain 抑制剂E-64 d(30 μg/ml,预处理1 h)自身并不增强pCREB 表达(P＞0.05),但能逆转2 μmol/L,2.5 μmol/L 和3 μmol/L 的ADDLs 引起的pCREB 下降(P＞0.05),却未能逆转0.5 μmol/L, 1 μmol/L 和1.5 μmol/L 的ADDLs 引起的pCREB 下降(P＜0.01);处理24,36 和48 h 情况与12 h 类似;各处理组在3,6,12,24,36 和48 h 时均未出现PKAC 的含量变化(P＞0.05)。(图1)

图1 Calpain 激活程度根据78 kDa/80 kDa 条带的比值衡量;0.5μmol/L ADDLs 不通过激活calpain 导致pCREB 下降, 而2 μmol/L ADDLs 则通过 激活calpain导致pCREB 下降;两者均未影响PKA 催化亚基两个亚型的含量;1 为对照组;2 为0.5 μmol/L ADDLs 组3为2 μmol/L ADDLs 组

3 讨 论

脑实质内和脑血管壁内Aβ 沉积是AD 的特征性病理变化之一,被认为是引起AD 早期记忆障碍的主要致病因素[1]。ADDLs 是Aβ 毒性最大的形式,对海马神经元、胆碱能神经元等多种神经元产生多种毒性作用,并影响突触的可塑性[5]。ADDLs 的主要毒性作用之一是通过在膜上形成离子通道或通过兴奋性谷氨酸受体等导致胞内钙浓度升高,从而可能激活calpain。激活的calpain 水解可能通过水解胞内多种与记忆相关的蛋白,影响记忆合成,因此抑制calpain 活性可能对治疗AD 有益。但抑制calpain 又可能加重tau 蛋白的聚集[6],而tau 蛋白的过度聚集也是AD 的特征性病理改变之一,对细胞有毒性作用,可加重AD 的发展。因此,当考虑通过抑制calpain 治疗A D 时可能需要选择一个合适的时机,即当激活的calpain 在记忆下降中发挥主要作用时。本研究结果显示,高浓度ADDLs 通过激活calpain 导致pCREB 下降,而低浓度ADDLs 不通过激活calpain 下调pCREB。Vaisid 等认为,ADDLs 浓度较低时也可激活calpain,但不是直接导致胞内钙浓度升高,而是经过激活caspase-8 来降解钙蛋白酶抑素(calpain 的内源性抑制物)来间接地增加calpain 的活性[7]。本研究延长观察窗至48h,仍未观察到低浓度的ADDLs 激活calpain,同时抑制calpain 活性也不能逆转低浓度ADDLs 导致的pCREB 下降,支持低浓度下调pCREB 不通过激活calpain。低浓度ADDLs 导致的pC REB 降低可能涉及许多机制,例如在小鼠海马神经元中可通过上调PKA 调节亚基含量,从而抑制PKA 催化亚基的核转位导致pC REB 下降[8];在小鼠皮层神经元和人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y5Y)中可通过激活某些磷酸酶如蛋白磷酸酶1,增强去磷酸化效应来降低pCREB[9]。但可以肯定的是,抑制calpain的活性对逆转低浓度的ADDLs 引起的pC REB 下降无效,提示抑制calpain 活性可能不是针对早期AD 患者的治疗方向。

本研究中高浓度ADDLs 通过激活calpain 导致pCREB 下降,这与大多数研究结果一致。但激活的calpain 如何下调pC REB 尚不得而知。本研究关注了PKA 的催化亚基(PKA-C),因为在形成pCREB 的各种激酶中PKA 扮演着重要角色,PKApCREB 通路在记忆形成中起着最重要的作用[10]。PKA-C 是PKA 磷酸化CREB 形成pCREB 的执行部分,有PKA-Cα和PKA-Cβ 两个亚型。激活的calpain 可能通过水解PKA-C,下调PKA 的活性来降低pCREB。但本研究结果显示,高浓度ADDLs导致calpain 激活时未出现PKA-C 含量下调,支持calpain 激活时下调pC REB 与PKA-C 的含量变化无关。这说明PKA-C 并不是激活的calpain 的良好底物,激活的calpain 通过水解PKA-C 外的其他蛋白导致了pC REB 的下降。无论calpain 通过水解何种蛋白下调pC REB,抑制calpain 的活性能完全逆转高浓度ADDLs 引起的pCREB 下调,提示针对进展期的AD 患者,抑制calpain 活性是可行的治疗方向之一。

综上所述,高浓度的ADDLs 通过激活calpain导致pCREB 下降, 而低浓度ADDLs 则通过其他途径下调pCREB,但两者均未影响PKA-C 的含量。这提示针对不同时期的AD 患者,由于其脑内ADDLs 浓度各不相同,治疗方向也不尽相同。浓度较高的进展期患者可拮抗calpain 的活性, 而针对早期低浓度ADDLs 的AD 患者则需要进一步的研究。

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