发酵条件对嗜热链球菌ST1发酵乳粘度的影响

张铁华，张春红，李盛钰，陈玉江，郑 健，杨贞耐，*

（1.吉林省农业科学院农产品加工研究中心，吉林长春130033；2.吉林大学军需科技学院，吉林长春130062）

发酵条件对嗜热链球菌ST1发酵乳粘度的影响

张铁华1，2，张春红2，李盛钰2，陈玉江2，郑 健2，杨贞耐1，2，*

（1.吉林省农业科学院农产品加工研究中心，吉林长春130033；2.吉林大学军需科技学院，吉林长春130062）

对一株产粘嗜热链球菌ST1的形态进行了观察，探讨了pH、温度、不同碳源和乳清浓缩蛋白（WPC）对嗜热链球菌ST1发酵脱脂乳粘度、酸度的影响。该菌株经活化，在全脂乳固体培养基上培养后、采用结晶紫染色，在显微镜下观察到菌体呈球形或卵形，链状分布，菌体表面没有荚膜。用ST1发酵10%脱脂乳，获得了不同发酵时间下表观粘度和滴定酸度的变化情况，优化出嗜热链球菌ST1发酵脱脂乳产粘的条件为：pH 6.5，温度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。

嗜热链球菌ST1，发酵脱脂乳，粘度，滴定酸度，发酵条件

脱脂乳经乳酸菌发酵后粘度会发生一定的变化，不同菌种凝乳的粘度不同，其中产粘较显著者称之为粘性菌株。产粘乳酸菌在发酵乳中的应用在法国和荷兰倍受重视，因为这些国家禁止在非果味酸奶中添加植物性或者动物性稳定剂。许多资料报道，乳酸菌产生的粘性物质成分复杂，通常含有多糖类化合物，有的粘性物质具有一定的抗癌性，有些粘性菌株具有显著的降胆固醇作用［1］。粘度与搅拌型酸奶的感官质量密切相关，搅拌型酸奶在货架期容易产生乳清析出现象，风味变差，同时降低了粘度。乳酸菌产粘特性受诸多因素的影响，如发酵温度、pH、培养基组成等，可以通过优化发酵条件的方式来提高脱脂酸奶的粘稠度，从而解决产品感官质量问题。国外很多研究者指出乳酸菌能够产生高分子量的多糖，从而提高发酵产品的粘度［2］。用产粘性多糖的德式保加利亚乳杆菌培养时，酸乳的粘度明显升高［3］。另外，粘性嗜热链球菌LY03产生大量的高分子量多糖，能显著提高发酵乳的粘度［4］。本研究对一株产粘的嗜热链球菌ST1在发酵凝乳过程中酸乳粘度和滴定酸度的变化进行了量化测评，优化了影响表观粘度变化的发酵条件，为新型低脂酸乳保健产品的开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖 均为食用级；乳清浓缩蛋白（WPC392） 购买于 ADF（American Dariyfoods）公司；进口脱脂奶粉 新西兰；伊利全脂奶粉 市售；嗜热链球菌ST1 来源于吉林省农业科学院农产品加工研究中心，菌种储存在-80℃条件下，用10%（w/v）脱脂乳添加30%（v/v）的甘油作为冷冻保护剂，嗜热链球菌在42℃下培养18h，活化三次后，用于后续的发酵实验；全脂乳固体培养基 10%（w/v）全脂乳、1.1%琼脂和0.01%刚果红，将琼脂用蒸馏水完全溶解，在微波炉内加热1min后倒入加有刚果红的全脂乳中，并快速搅拌均匀，然后将全脂乳琼脂培养液115℃灭菌15min后进行倒板；脱脂乳液体培养基 10%（w/v）脱脂乳，在115℃灭菌15min后作为发酵培养基，起始 pH用0.1mol/L NaOH和1mol/L乙酸进行调节，碱和酸均用0.22μm的微孔滤膜进行过滤后加入已灭菌的脱脂乳中。

Brookfield DV-Ⅲ粘度仪 Brookfield Engineering Labs Inc.，Stoughton，MA；HY-5A型回旋式振荡器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DHP-9272恒温培养箱 上海一恒公司；正置荧光显微镜 日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜热链球菌ST1的形态特征观察 在全脂乳固体培养基上培养ST1 8h后，在刚果红形成的浅红色背景下获得肉眼可见的乳白色菌落。挑取一环菌落放在载玻片上，加一滴墨汁，用盖玻片轻轻平铺成平面以便观察，然后放在无菌操作台上用风吹干，加一滴结晶紫进行染色30s～1min并风干后用蒸馏水轻轻冲洗掉结晶紫，然后在显微镜下进行观察。

1.2.2 发酵乳表观粘度的测定 将酸奶样品浸没于粘度计转子刻度以上，放入温度探棒，待温度稳定在20℃之后，转速为100r/min，用3号转子测定1min后的表观粘度。

1.2.3 发酵乳酸度的测定 吸取10mL发酵乳，置于100mL的三角瓶中，加入蒸馏水20mL，加入1滴0.5%的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红色，在1min内不消失为测定终点（终点用0.005%碱性品红溶液做对照）。具体计算：

式中：VNaOH为消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V1为空白溶液消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；CNaOH为标准氢氧化钠溶液的浓度，mol/L。

1.2.4 取样 用嗜热链球菌ST1发酵10%（w/v）脱脂乳48h，接种量1%。从0时刻起开始收集样品，以后每隔16h取样，测定表观粘度和滴定酸度。

1.2.5 数据统计分析方法 本研究采用两次独立的重复实验，每次做三个平行实验；采用Sigma plot 10.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 嗜热链球菌ST1的形态特征

在正置荧光显微镜下嗜热链球菌ST1的个体形态见图1，菌体呈球形或卵形，成链状排列，菌体表面没有荚膜。

图1 嗜热链球菌ST1的个体形态特征

2.2 发酵条件对发酵乳粘度、酸度的影响

2.2.1 pH对发酵乳粘度、酸度的影响 在37℃不同初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）条件下用ST1发酵脱脂乳，结果如图2，可以看出，在相对较低的pH（5.0、5.5、6.0）条件下，菌体不能充分利用营养物质来满足自身的生长，生成多糖和分解蛋白质等大分子物质的能力较低［5］，使得发酵乳的粘度相对较低，对应的最大粘度值在发酵32h或48h后获得，分别为128.4、198.0、190.8cps。在pH6.5条件下发酵至32h，菌体生长情况良好，发酵乳的粘度和酸度均呈现直线增加趋势，产粘和产酸情况很好，最大值分别为369.5cps（32h）和86.9°T（48h）。在pH7.0条件下，菌体的产粘情况比pH6.5条件下稍差些，但优于较低pH（5.0、5.5、6.0）条件下的产粘情况。根据上述结果，确定pH6.5为嗜热链球菌ST1发酵脱脂乳的最佳初始pH，用于后续实验中。

图2 不同pH对发酵脱脂乳表观粘度（a）和滴定酸度（b）的影响

2.2.2 温度对发酵乳粘度、酸度的影响 在pH6.5不同温度（30、37、42℃）条件下用ST1发酵脱脂乳，从图3可以看出，在发酵过程中，30℃时发酵乳在发酵后期的滴定酸度高于37℃和42℃时的酸度，并在发酵至32h获得了最大值134.1°T，而37℃和42℃发酵过程中得到的滴定酸度差异不大。有关粘度的实验结果表明，菌株在低于其适宜生长温度时产粘较低，随着温度的升高粘度呈上升趋势。30℃时，菌体生长缓慢，随着发酵时间的延长粘度逐渐增加，在发酵至48h获得最大粘度值（173.5cps）；37℃时发酵至32h获得了最大的粘度值（191.2cps）。42℃发酵产生的最大粘度值（259.6cps）大于30℃和37℃的最大粘度值，并且在发酵16h后获得。上述结果表明酸度与粘度呈一定的负相关［6］，酸度越高，酸奶的粘度越低，可能是酸度过大破坏了发酵乳已形成的胶体结构，使乳清分离，从而影响酸奶的粘度，也可能是高酸度环境对胞外多糖保持其质构有影响。同时，ST1在较高温度下发酵更有利于发酵奶在最短的时间内提高粘度；而 Lactoccus lactis subsp cremoris LC 320在20～35℃范围内其粘度呈较高的水平，在35℃时有所下降［7］。有关乳酸菌产粘特性受温度的影响作用在国外已有许多报道，Garcia-Garlbay等的研究报 道： Laccobacillus delbrueckll ssp bulgaricus NCFB2772在较高的温度时表现出优良的产粘特性［8］，Grobben等对该菌株的产粘特性的研究表明：在42℃培养温度下，NCFB2772可以产生较大粘性，但在高于45℃时产粘急剧下降，甚至失去了产粘特性［9］。

图3 不同温度对发酵脱脂乳表观粘度和滴定酸度的影响

2.3 碳源对发酵乳粘度、酸度的影响

在pH6.5，42℃条件下用ST1发酵加入2%（w/v）不同碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖）的脱脂乳，用空白脱脂乳作对照。从图4可以看出，在脱脂乳中添加不同的碳源，发酵乳粘度值有不同的变化。相对于空白脱脂乳发酵至16h获得最大粘度值（259.6cps），添加碳源后发酵脱脂乳获得最大值的时间延长，在发酵至32h获得。碳源对粘度的影响效果为果糖（600.0cps）＞乳糖（479.0cps）＞蔗糖（298.0cps）＞ 葡 萄 糖（271.0cps）＞ 半 乳 糖（195.3cps）。有关酸度的实验结果表明，与加入其他碳源相比，加入半乳糖的发酵乳中滴定酸度相对较低。发酵至48h，果糖（98.1°T）＞乳糖（91.0°T）＞蔗糖（83.4°T）＞葡萄糖（76.5°T）＞半乳糖（65.0°T），均低于空白样发酵至48h得到的滴定酸度（104.5°T）。碳源的添加使得菌体的生长情况更好，分解蛋白质和合成粘性物质的能力得到提高，ST1利用果糖、乳糖和蔗糖的效果较好，而利用半乳糖的效果较差。并不是所有的嗜热链球菌有能力利用蔗糖，从粘度和工业大量生产的低成本要求考虑，嗜热链球菌ST1利用蔗糖效果较好，可以应用于甜制发酵乳品中。

图4 不同碳源对发酵脱脂乳表观粘度（a）和滴定酸度（b）的影响

2.4 氮源对发酵乳粘度、酸度的影响

据报道，应用乳清浓缩蛋白可以为酸奶提供独特的功能特性，可改善酸奶的风味、硬度和粘度，降低酸味感，防止乳清析出［10-12］。在pH6.5，42℃下用ST1发酵加入0.5%（w/v）WPC392的脱脂乳，从图5可以看出，在发酵过程中，滴定酸度随着发酵时间的延长不断增加，发酵初期增加速度较快，发酵至16h趋于稳定，发酵48h后的滴定酸度分别为93.0°T（空白脱脂乳）和79.4°T（加WPC392的脱脂乳）。发酵至16h，对照组发酵乳的粘度达到最大值259.6cps；发酵至32h，添加WPC392的发酵乳粘度达到最大值270.3cps。牛龙江等人的研究指出，蛋白质具有较强的缓冲能力，酸奶贮藏过程中，乳清蛋白的缓冲作用能防止乳酸过多引起的pH急剧下降，从而有利于产品中保持较高的乳酸活菌菌数，并延缓了酸乳因酸度降低而引起的品质变差［13］。酸奶中的乳酸菌进入衰亡期后还有部分菌有一定的活力，能够分解蛋白质，使酸奶的质构受到破坏，从而引起粘度下降和滴定酸度的增加。

图5 WPC392对发酵脱脂乳表观粘度和滴定酸度的影响

3 结论

3.1 本研究采用的添加有刚果红的全脂乳固体培养基，首次应用在嗜热链球菌菌落分离中，在其他文献中未见报道；在浅红色背景下，培养ST1 8h后可以获得清晰的乳白色菌落；菌体经结晶紫染色，在显微镜下观察呈球形或卵形，成链状排列，菌体表面没有荚膜。

3.2 嗜热链球菌ST1发酵脱脂乳产粘适宜条件：pH 6.5，温度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。嗜热链球菌ST1利用蔗糖效果较好，可以应用于甜制发酵乳品中。

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Effect of cultural conditions on the viscosity of fermented milk by Streptococcus thermophilus ST1

ZHANG Tie-hua1，2，ZHANG Chun-hong2，LI Sheng-yu1，CHEN Yu-jiang2，ZHENG Jian2，YANG Zhen-nai1，2，*
（1.Center of Agro-food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China；2.College of Light Industry and Economics&Management，Jilin University，Changchun 130062，China）

The morphologic characteristics of a slime-producing strain，Streptococcus thermophilus ST1 were studied.By crystal violet staining，the strain grown on a full-fat milk solid medium was observed by microscopy to be globular or oval without capsules on the bacterial surface，and the bacteria cells were presented in chains.The effects of pH，temperature，supplementation with carbon sources and whey protein concentrate（WPC）on the viscosity of fermented skim milk by S.thermophilus ST1 were studied when the strain was grown in 10% reconstituted skim milk.According to the results of the apparent viscosity and titration acidity of the fermented samples，the optimized cultural conditions for slime production by S.thermophilus ST1 were pH 6.5，temperature 42℃，2%（w/v）sucrose or 0.5%（w/v）WPC392.

Streptococcus thermophilus ST1；fermented skim milk；viscosity；titration acidity；fermentation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0206-04

2010-01-08 *通讯联系人

张铁华（1970-），男，博士，副教授，研究方向：农产品精深加工。

现代农业产业技术体系建设专项资金资助（nycytx-0502）；吉林省科技发展计划项目（20090225）。