蔬菜根结线虫生防细菌的筛选

黄金玲，刘纪霜，刘志明，，陆秀红，潘萍红，陆光艺，秦碧霞，李国栋，

(1 广西农业科学院植物保护研究所，广西南宁 530007;2 南宁市试验中心，广西南宁 530001;3 广西大学农学院，广西南宁 530005）

近年来根结线虫Meloidogyne spp.在蔬菜上发生日趋严重，给蔬菜生产造成巨大损失.生产中主要以化学杀线剂来防治，但目前杀线剂品种少，且多为高毒、高残留农药，不适合在蔬菜上使用.因此生物防治受到广泛重视，根结线虫生物防治天敌资源也在世界不同国家和地区被广泛调查和筛选［1-6］.细菌由于易于培养、定殖，与植物根际具有较强的亲和力，应用前景广阔.本试验在广西开展了蔬菜根结线虫生防细菌的筛选，以提供适合当地的生防菌株，为开展无公害防治蔬菜根结线虫奠定基础.

1 材料与方法

1.1 根际细菌的采集与分离

在广西蔬菜产地采集番茄Solanum lycopersicum、白菜 Brassica pekinensis、芹菜 Apium graveolens、豆角Vigna unguiculata spp.、红薯 Ipomoea batatas、黄瓜Cucumis sativus、丝瓜 Luffa cylindrica、南瓜 Cucurbita moschata等作物的根际土壤样品(包括无根结线虫土、根结线虫土及根结线虫衰退土).采用稀释分离法，于NA培养基平板上进行根际细菌的分离，所得分离物纯化后保存、备用.

1.2 供试根结线虫的繁殖与准备

供试根结线虫为南方根结线虫Meloidogyne incognita(Kofoid and White，1919)Chitwood，1949.采用活体繁殖方法，将番茄苗种到南方根结线虫病圃中繁殖.从感病的番茄根部挑取南方根结线虫新鲜卵块，用φ为1%NaClO溶液表面消毒后，用灭菌水冲洗3次，置25℃恒温箱中孵化.待孵化后收集幼虫，并配制成约100条/mL的线虫液，备用.

1.3 生防菌室内筛选

细菌菌悬液对线虫的作用测定:将分离到的菌株接种于NA固体培养基上，28℃条件下培养24 h后用无菌水配成109CFU/mL的菌悬液.分别吸取1 mL菌悬液和1.2中配好的线虫悬浮液0.5 mL，加入到灭菌的培养皿中，置25℃下培养48 h，然后在体视显微镜下检测线虫的死亡率.以1 mL无菌水加0.5 mL线虫悬浮液作为对照，每个菌株3个重复.

细菌发酵液对线虫的作用测定:将细菌菌悬液室内离体测定线虫校正死亡率达到80%以上的菌株接种于NA液体培养基中，30℃条件下振荡培养48 h后，10000 r/min离心10 min，取上清液.同时将上清液原液稀释成2倍液和5倍液，然后分别将上清液原液、上清稀释液1 mL加入到灭菌的培养皿中，加入0.5 mL配好的线虫悬浮液，一起放在25℃恒温箱中培养，分别在24、36和48 h在体视显微镜下检测并计算线虫的死亡率，无菌水培养作为对照，3次重复.

2 结果与分析

2.1 细菌菌悬液对线虫的作用

从蔬菜地无根结线虫土、线虫衰退土、根结线虫土中采集和分离到359株细菌菌株，有336株菌株在一定程度上表现出杀死南方根结线虫二龄幼虫的能力(以虫体僵硬，用针触不动的线虫视为已死亡的线虫).用109CFU/mL的菌悬液处理幼虫48 h，线虫校正死亡率在90%以上有2株菌株，占0.55%;校正死亡率在80% ～90%有7株菌株，占1.95%(表1);校正死亡率在 70% ～80%的有 21株菌株，占5.85%;校正死亡率60% ～70%的有19株菌株，占5.29%.

表1 菌悬液处理48 h南方根结线虫二龄幼虫室内校正死亡率达到80%以上的菌株Tab.1 Strains which the revised mortality of M.incognita J2 were over 80%in vitro condition after 48 h treatment

2.2 细菌发酵液对线虫的作用

从表2可以看出，处理后 24、36和48 h后，各发酵上清液原液及其不同稀释倍数液对南方根结线虫二龄幼虫均表现出一定的致死作用，且大部分是随处理时间而逐渐增强，48 h后有8株菌株的发酵原液校正死亡率达到80%以上，其中17号、119号、155号、333号菌株的发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率均比菌悬液处理高.发酵液经过稀释后，对幼虫的致死作用减弱，稀释5倍液对幼虫的校正死亡率均低于50%，稀释2倍液还表现出较好的作用，处理48 h有6个菌株对幼虫的校正死亡率仍可达到50%以上.

表2 生防菌菌株发酵滤液及其不同稀释倍数液对二龄幼虫的校正死亡率1)Tab.2 The revised mortality of M.incognita J2 treated with ferment of strains in different concentrations %

3 结论

本试验从无根结线虫病土壤、根结线虫衰退土和根结线虫病土3种不同的土壤分离生防细菌，扩大了筛选范围试验.以对生产造成严重危害的南方根结线虫二龄幼虫作为供试线虫，采用了收取卵块人工孵化的方式获取大量根结线虫二龄幼虫进行离体测定，来衡量生防菌毒力的高低，因在虫龄、食性等方面差异小，可比性较强.

室内离体拮抗测定结果表明:有336株菌株在一定程度上表现出对南方根结线虫二龄幼虫有致死作用，49株菌株对南方根结线虫的室内校正死亡率达60%以上;从线虫衰退土中分离到64个菌株，经室内毒力测定，校正死亡率在80%以上的有3个菌株.说明广西土壤富含大量对植物寄生线虫有抗性的根际细菌，是一类重要的线虫生防资源，而本地资源相对引进资源更易于定植，因此有待加强研究与开发利用.

研究结果还发现，有些菌株的发酵液对南方根结线虫二龄幼虫表现出较好的致死作用，效果甚至比菌悬液处理还好，但发酵上清原液经过稀释后对幼虫致死作用均下降，这可能是由于有些细菌通过产生毒素代谢物或抗生素来毒杀线虫，而稀释后代谢物浓度降低使效果降低，其作用机制及代谢物的主要成分，还有待进一步的研究.

［1］汪来发，杨宝君，李传道.华东地区根结线虫天敌真菌调查［J］.菌物系统，2001，20(2):264-267.

［2］何胜洋，葛起新.南方根结线虫天敌真菌［J］.植物病理学报，1987，17(1):14-21.

［3］王明祖，吴秋芳.根结线虫卵寄生真菌的研究［J］.华中农业大学学报，1990，9(3):225-229.

［4］张克勤，高恩 S，巴巴拉 T.根结线虫天敌真菌极其高效菌株筛选［J］.真菌学报，1993，12(3):240-245.

［5］杨秀娟，何玉仙，陈福如，等.福建省根结线虫卵囊真菌的分离与筛选［J］.福建农业学报，2000，15(1):12-15.

［6］祝明亮，奚家勤.云南烟草根结线虫拮抗真菌分离鉴定初报［J］.云南大学学报:自然科学版，2004，26(2):1741-78.