鸡排泄物中洛克沙胂与多价态As的分离与测定方法研究

曾 婧，卓家珍，陈杖榴，孙永学

(华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）

洛克沙胂(Roxarsone，ROX)是近十几年来被广泛用作畜禽促生长的一种有机胂添加剂，经畜禽摄入后大部分经排泄物排出体外并进入周边环境中.国外对畜禽粪便中总As含量及其代谢物的检测已有报道［1-2］，结果表明排泄物中以ROX为主，亦检测到的不同价态As.关于ROX原形的测定已有氮定法［3］、GC 法［4］和 HPLC 法［5-6］等，用于砷价态分析的分离方法有多种，其中以离子交换树脂法最为常用［7-8］，原子荧光法(AFS)亦常用于总 As及无机As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的痕量测定.本文通过建立鸡排泄物中ROX、总As及无机As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分离与测定，旨在为研究洛克沙胂在鸡饲喂后的排泄及消除规律提供检测基础，亦将为ROX在环境中的残留与生态毒理学评估提供依据.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

洛克沙胂对照品，纯度99.6%，批号20051214，由广州惠华动物保健品公司提供;砷标准储备液，含砷1000 mg/L，批号2070314，由国家标准物质中心提供;三氧化二砷(As2O3)，纯度≥99.9%，由Sigma公司提供;砷酸氢二钠，纯度≥99.9%，由BBL公司提供.其他化学试剂均为色谱纯或分析纯级.试验用水为超纯水.

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪，Agilent 1100型，美国Agilent公司生产;双道原子荧光光度计，AFS-9130型，北京吉天仪器有限公司生产;微波消解系统，Ethos1型，意大利Milestone公司生产;Straxa-X-AW型固相萃取小柱(3 mL)，美国Phenomenex公司生产;717型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、732型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，均由杭州市争光树脂有限公司提供.

1.3 标准试液配制

洛克沙胂储备液:称取洛克沙胂对照品100.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，加适量流动相定容成1000 mg/L储备液，4℃保存备用.砷标准使用液(1 μg/mL):由砷标准储备液用φ=5%盐酸溶液逐级配制而成.砷(Ⅲ)标准储备液(1 mg/mL):称取干燥As2O31.320 g溶于25 mL 200 g/L KOH溶液中，以H2SO4(φ=20%)定容至1000 mL摇匀;砷(Ⅴ)标准储备液(1 mg/mL):称取干燥砷酸氢二钠1.650 g溶于纯水中，用 H2SO4(φ=20%)定容至1000 mL摇匀.均用φ=5%盐酸溶液逐级稀释.

1.4 鸡排泄物中洛克沙胂含量的测定

1.4.1 提取 取1.00 g空白鸡粪于离心管中，依次添加10 μg/mL洛克沙胂标准溶液100 μL和10 mL提取液［V(0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液)∶V(甲醇)=90∶10］，震荡提取30 min(60℃)，残渣2次提取，合并上清液.加入100 g/L硫酸铜溶液2 mL，混匀静置20 min，以8000 r/min离心5 min，过滤至25 mL容量瓶中，提取液定容，调pH至4.0～5.0，待净化.

1.4.2 SPE净化 将Straxa-X-AW小柱用3.0 mL甲醇活化和超纯水平衡后，分2次加入5.0 mL提取液.依次用6.0 mL甲酸(φ=1%)淋洗和6.0 mL氨甲醇(φ=5%)洗脱洛克沙胂，负压抽虑后洗脱液在60℃水浴吹干，加1.0 mL流动相溶解，经0.22 μm针头式过滤，滤液供检测.

色谱条件为 Prsil BDS C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm);紫外波长266 nm;流动相为V(0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液)∶V(甲醇)=90∶10，pH=2.5;进样量为 20 μL.

1.4.3 标准曲线、回收率与变异系数的测定 取空白鸡粪1.00 g于离心管中，加入100 μL洛克沙胂标准系列(5～500 μg/mL)，制得系列质量比为0.5～50.0 μg/g，按上法处理与测定，由质量比(C)与峰面积(S)求得标准曲线.在1.00 g空白粪样中分别加入10、50 和 200 μg/mL 洛克沙胂溶液各 100 μL，制得质量比为1.0、5.0和20.0 μg/g，重复 6次，计算回收率.以上3个制得质量比各设6重复，共4批次，求批内、批间变异系数.

1.5 鸡排泄物中总砷含量的测定

1.5.1 样品处理 取0.50 g空白鸡粪于微波消化罐内，添加0.5 mL 1 μg/mL砷标准使用液、2 mL HNO3和0.5 mL H2O2，密封后设最佳消解条件消解.消解液经水浴赶酸、还原、纯水定容至25 mL后上AFS机检测，设空白样进行相对标准偏差(RSD)和检测限(LOD)测定.由荧光强度(If)根据标准曲线方程求空白液和样品中砷质量浓度.AFS测定条件:载液为盐酸(φ=5%)，还原剂为硼氢化钾(20 mg/mL)，负高压270 V，灯电流60 mA，载气流量400 mL/min.

1.5.2 标准曲线、回收率和变异系数的测定 吸取1 μg/mL砷标准使用液2.5 mL于容量瓶中，加入1.25 mL浓盐酸、2 mL还原剂，纯水定容并自动稀释测定 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列质量浓度的荧光值制备标准曲线.取5份空白鸡粪，测本底值和空白样添加5个砷标准系列质量浓度(10、20、40、60、80 μg/L)，各设 5 个重复，计算回收率和变异系数.

1.6 鸡排泄物中无机As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分离测定

1.6.1 样品提取 取1.00 g空白鸡粪于15 mL离心管中，各添加0.1 mL As(Ⅴ)和As(Ⅲ)标准工作液(1.0 μg/mL，制得质量比均为 0.1 μg/g)，加 10 mL提取液(0.6 mol/L磷酸二氢钾溶液)，振荡并离心，取上清液(重提2次)调pH至5.0，进行树脂分离:提取液经0.45 μm滤膜过滤至阳离子树脂中，振荡后入阴离子交换树脂柱(流速1.5 mL/min)，收滤液加入2.5 mL浓盐酸，纯水定容至50 mL，待测未吸附的As(Ⅲ);用20 mL 0.5 mol/L醋酸－醋酸铵缓冲液淋洗树脂柱，弃解析液，用30 mL 0.2 mol/L盐酸淋洗，收解析液，纯水定容至50 mL，待测As(Ⅴ).均上AFS机检测，同时设空白样.

1.6.2 标准曲线、回收率和变异系数的测定 分别取1.0 μg/mL As(Ⅴ)、As(Ⅲ)标准溶液 0.1 mL 于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL浓盐酸，纯水定容，自动稀释测定 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列质量浓度的荧光值制备标准曲线.先取5份空白鸡粪测得本底值后，空白添加As(Ⅴ)、As(Ⅲ)标准液(添加质量比为0.05、0.50 和5.00 μg/g，5次重复)测定.计算回收率和变异系数.

2 结果与分析

2.1 鸡排泄物中洛克沙胂含量的测定

在空白粪样中添加0.5～50.0 μg/g洛克沙胂系列质量比，经系列处理后进行HPLC测定可获得较好的回收率和净化效果，线性关系良好(r≥0.9994)，回收率为75.82% ～79.36%，批内变异系数为2.75% ～5.71%，批间变异系数为4.22% ～5.11%，ROX能与排泄物中其他组分较好地分离，保留时间约7.6 min，表明本法精密度高、稳定性和重复性好.色谱图见图1、图2.

图1 鸡空白粪的色谱图Fig.1 Chromatograms of the bland excreta sample of chicken

图2 鸡空白粪添加标液(10.0 μg/mL)色谱图Fig.2 Chromatograms of the bland excreta sample spiked with arsenic(10.0 μg/mL)

2.2 鸡排泄物中总砷含量的测定

采用HNO3-H2O2(体积比4∶1)消解液可将样品完全消解，呈澄清透明溶液.总砷质量浓度在2～100 μg/L范围内线性良好(r＞0.999)，检测限(LOD)为0.08 μg/L，回收率为94.69% ～109.17%，变异系数介于1.50% ～4.74%，符合检测要求.

2.3 鸡排泄物中无机As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的分离测定

As(Ⅲ)、As(Ⅴ)标准曲线在 0.5 ～100.0 μg/L范围内线性良好(r＞0.999).在相同反应条件下As(Ⅴ)、As(Ⅲ)荧光强弱不同，前者约为后者的1/3.As(Ⅴ)的 LOD 为 0.21.0 μg/L，As(Ⅲ)的 LOD为0.084 μg/L.As(Ⅲ)回收率为 87.8% ～113.0%，变异系数为1.90% ～5.39%;As(Ⅴ)回收率为81.1% ～127.3%，变异系数0.96% ～3.54%.均可满足检测要求.

3 讨论

3.1 洛克沙胂原形的提取与净化

对洛克沙胂的提取，所报道的方法不尽相同，常用超声提取或水浴振荡［5，9-10］.本试验中对比了甲醇、0.05 mol/L磷酸氢二钾－甲醇混合液、0.05 mol/L磷酸氢二钾及20 g/L磷酸氢二钾等4种提取液的提取效果，综合比较干扰度、杂峰、用量及操作性等，最后选用0.05 mol/L磷酸氢二钾－甲醇混合液按90∶10(体积比)2次提取，达到较好的效果.为克服鸡粪中蛋白成分的干扰，通过比较了高氯酸、三氯乙酸、硫酸铜等，选用100 g/L硫酸铜溶液除蛋白效果为最佳.鸡排泄物的成分复杂，为充分去除基质的干扰，通过比较活性炭萃取小柱与弱阴离子柱Waters OasisRMAX［5］、强阴离子柱SAX与强阳离子柱SCX［11］等，以固相萃取小柱SAXj净化效果为最佳.按以上筛选的处理方法，与AOAC(美国公职分析化学家协会)规定的标准方法一致.

3.2 微波消解条件的选择及优化

已有报道采用微波消解处理排泄物，进而测定砷含量［12］.本文比较了 HNO3、HNO3+(HClO4、HF或H2O2)4种消解体系及不同用量的效果，结果表明:2.5 mL 提取液［V(HNO3)∶V(H2O2)=4∶1］的效果最理想，利于赶酸、荧光值大、重现性好且消解完全呈清亮.

3.3 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)提取条件的选择

在各种形态砷中，无机砷毒性大于有机胂，又以无机As(Ⅲ)毒性最强.目前分离砷形态方法有GCMS、IC-AES、HPLC-HG-AFS、HPLC-ICP-MS 等［13-16］.离子交换树脂价廉且操作简单，多用于砷形态分析［17］.AFS法测定砷含量的方法成熟，故本文中先将砷几种形态加以分离，再用AFS法可测得排泄物中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)含量.因 AFS只识别 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA，需将它们分离并去除DMA、MMA干扰.DMA在酸性条件下可吸附在阳离子树脂上，而MMA可吸附于阴离子树脂，本试验中通过先后采用阳、阴离子树脂的吸附与洗脱从而去除干扰.

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