兴安石竹茎段离体繁殖的研究

2010-11-09李桂君宋嘉隆

黑龙江生态工程职业学院学报 2010年2期

关键词：石竹茎段兴安

李桂君宋嘉隆吴捷

(黑龙江省林业科学研究所森林培育室,哈尔滨 150080)

兴安石竹茎段离体繁殖的研究

李桂君宋嘉隆吴捷

(黑龙江省林业科学研究所森林培育室,哈尔滨 150080)

以兴安石竹单节茎段为试材进行离体培养,通过腋芽增值途径产生再生植株,筛选出了较适宜的诱导培养基,继代增值培养基和生根培养基,建立了完整的组织培养快繁体系。

兴安石竹;茎段离体培养;腋芽增殖

兴安石竹 (Gypsophila davuricaTurczex)自然分布于东北内蒙古的草原、丘陵、固定沙丘及石砾质山坡地带[1,2]为多年生宿根草本植物,植株高约 20～30cm,茎节明显,叶狭长,对生于茎节处,花为粉色或紫色,花朵繁茂艳丽,茎叶洁净翠绿十分美观,可在园林绿化中广范应用。同时它又是花卉育种的良好原始材料,花卉栽培品种中十分流行的康乃馨 (香石竹)和常夏石竹 (地被石竹)均是它的近亲。兴安石竹的根含皂苷可入药,性味归经,味甘,性微寒,有逐水利尿之功效,用于水肿胀满、胸肋满闷、小便不利等有显著效果。兴安石竹虽然分布较广,但多呈零星散生状态,无大面积集中分布,因而资源总量不多。加上在园林和医药上的应用价值,常常被人们采挖。其资源已明显日趋减少。若不采取措施加以保护,资源会日渐枯竭。兴安石竹扦插不易生根,研究其组培技术并建立可行的快繁体系,对于扩大种群数量,发挥其在遗传育种、园林栽培、医药等方面的重要作用并进一步开发利用都有十分重要的意义。迄今,兴安石竹组织离体培养方面的研究尚未见报道。

1 材料和方法

6月上旬植株开始旺盛生长时,采下健康的嫩茎作为实验材料。实验材料先用水洗去表面的灰尘,从节间处剪成带叶的茎段和带叶的顶梢。为了实验材料一致和方便,本实验主要使用茎段,仅用少数顶梢作为对比观察。若叶片较长可将叶片前端的三分之一剪掉,将留下的材料放入清水中,滴入几滴洗涤剂摇动片刻,用自来水冲去泡沫后,再换水 4～5次将材料洗净,然后将材料浸入次氯酸钙的饱和水溶液中,盖紧瓶塞灭菌 15～18min,其间不时摇动。灭菌完毕后在超净工作台内倒掉消毒液,用无菌水冲洗 5遍,取出,用无菌滤纸将材料表面多余的水分吸干后备用。

接种时先用手术刀将材料的剪口部位切去,用长镊子夹取材料并将其直接插入培养基约 0.8～1.0cm并使其保持直立,每个培养基组合接 6瓶,每瓶接种材料 5个,接种后一周内及时观察杂菌污染情况,若发现培养瓶内发生污染立即把未污染的材料转移到新鲜的培养基或重新接种补齐。接种分别使用MS、H和 WH ITE三种基本培养基,补加0.5～2.0(单位:mg/L下同)的 6-苄基嘌呤 (BA)或1.0的 6-呋喃氨基嘌呤 (KT),0.05的α-萘乙酸 (NAA)和 1%～4%的蔗糖,为了便于单因子比较培养基组合详见表1。

继带增殖使用的培养基为:MS+BA0.5+NAA0.02+2%蔗糖和WH ITE+BA0.5+NAA0.02+2%蔗糖。

生根培养基按表2配制,其组成成分见表2。

培养基配完后加 0.6%的琼脂粉,溶化后用0.1N的NaOH将 pH调至5.8分装后在1kg/cm2条件下热压灭菌20min。

接种后的材料置于架上光照培养。培养时昼夜温度变化于 20～25℃,白天补充日光灯照明 14h,光强度 2000ix。

试管苗移栽采用珍珠岩、蛭石、沙壤土三种基质。

2 结果和讨论

2.1 诱导培养

材料接种后约一周,对生的腋芽开始膨胀。再经 5～6d腋芽开裂从一侧或两侧同时长出新的幼芽。接种后 20d新芽进入正常生长阶段。部分材料由于太过细弱或由于灭菌时间过长使外植体受到药害,逐渐黄化枯萎。接种后 25d时调查材料生长情况见表1。

表1兴安石竹单节茎段在不同培养基组合中的诱导情况(接种后 25d调查)

在以MS为基本培养基的组合中,以 BA1.0+NAA0.05和 2%蔗糖的 2号培养基的生长情况最好,诱导率高达82.72%,BA的浓度为2.0和 0.5时诱导率分别下降为76.77%和60.00%……。在用KT1.0取代BA1.0的 4号培养基中,诱导率为74.87%,说明在本实验条件下,KT的效果不及 BA。因此,激素的合理使用对诱导效果有重要作用[3,4]。若仍采用较优的 2号培养基的激素组合,而只将蔗糖浓度调整到 1%和 4%,诱导率则分别下降到56.67%和30.00%,这说明在兴安石竹的茎段培养中,蔗糖浓度不宜偏高或偏低,蔗糖浓度为 4%时的诱导率较 2%时降低幅度达52.72%,所以,较高的蔗糖浓度尤其不宜。

从同时进行的 7号和 8号培养基组合来看,无机盐总量中等的 H培养基和无机盐总量偏低的WH ITE培养基,其诱导率分别为72.41%和46.43%,均低于有同样附加成分的MS培养基。看来,在兴安石竹茎段诱导培养阶段,仍以无机盐总量偏高的MS效果为好,无机盐总量偏低的WH ITE培养基其诱导效果最差。

2.2 继代增殖

当材料长到 3～4cm高时,可从节间处将其剪成单节茎段,转入继代培养基中进行增殖。继代培养采用 MS和WH ITE两种基本培养基,由于此时试管苗内的激素成分已有所积累,故将 BA和 NAA浓度分别降至0.5～0.02。这时的材料已完全适应培养基的条件且处在旺盛生长期,无论是顶梢还是中段,生长速度和增殖速度都很快,30～40d即可布满整个培养瓶。通过比较发现,从两种继代增殖培养基的效果看,MS培养基好于WH ITE培养基,可能是后者因无机盐含量低,营养条件不足所致。经统计,此阶段试验材料的月增殖系数可达到4.5～5.0甚至更高,完全能够满足建立快繁体系的要求。

2.3 诱导无根苗生根

将继代增殖的材料从节间处剪成双节茎段扦插在生根培养基中,15～18d茎基部开始生根,第25d调查的生根情况见表2。

表2 兴安石竹无根试管苗在生根培养基中的生根情况(转瓶后 25d调查)

从表2可以看出,不同培养基组合,其生根率有明显差别,在激素相同的情况下,MS(半)的生根率高于MS培养基。这表明在生根阶段适当降低培养基的无机盐浓度有利于生根,这与其他作者的结果一致[5,1]。而基本培养基同为MS(半),NAA、 IAA和 IBA也同为0.5时,其生根率分别为 88%、80%和 84%。使用 NAA者生根率最高,但根较细弱,且茎基部有少量组织;使用 IAA时,生根率较低,但根较长,茎基部无愈伤组织;而使用 IBA者,生根率较使用 NAA时略低,但根较粗壮,且茎基部无愈伤组织。三者综合比较,使用 IBA者根较健康,且茎基部无愈伤组织产生,因此效果最好。

2.4 试管植株移栽

试管植株生根后,增加自然光照强度,使其更加健壮,当根生长至1.5～2.5cm长时移栽效果最好。此时可去掉瓶塞,练苗 3～4d备用。

移苗基质为珍珠岩、蛭石和壤土加沙土 (1∶1),但后者事先经过了消毒处理,以防杂菌污染。栽苗的容器采用小号营养杯或植苗盘。

移栽时,仔细取出瓶苗,用清水洗去根部的培养茎,勿伤根系,移后,覆好基质,压实,浇足水,置于光线充足又无阳光直射处缓苗。在幼苗上方覆以塑料膜保持空气湿度,每天适量喷水并适时打开塑料膜通风换气,隔日用 1%～3%波尔多液喷雾,防止病害发生,1个月后去掉塑料膜进入正常管理。经调查,首批移栽入珍珠岩、蛭石和沙壤土中的试管菌成活率分别为85.00%、90.00%和81.67%。

兴安石竹试管植株移栽时,有两个问题值得注意:一是试管植株本身具有完整根系,植株健康;二是移栽条件要有保障,基质温度 23～25℃;基质 (土壤)含水量 16%～18%,水分不宜过大;空气相对湿度 65%～70%。只要满足上述条件,移栽成活率可达 90%以上。

已有不少研究证实,利用腋芽增殖,产生的再生植株在遗传上相对稳定,因此这一途径已在不少植物的快繁上得到了应用。