谷氨酸转运体基因多态性与犬行为性状的关联性分析

徐 黎 叶俊华 杨前勇 马长书 付平峰 李德贵 杨利国

谷氨酸转运体基因多态性与犬行为性状的关联性分析

徐 黎 叶俊华 杨前勇 马长书 付平峰 李德贵 杨利国

兴奋性氨基酸是广泛存在于哺乳类动物中枢神经系统的正常兴奋性神经递质，参与突触兴奋传递，学习记忆形成以及与多种神经变性疾病有关。EAA包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）、亮氨酸等等。其中谷氨酸是中枢神经系统内含量最高的氨基酸。目前有学者认为在中枢神经系统（CNS）损伤中，兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的失衡，对激发兴奋毒性起一定作用，故是造成脑损伤的因素之一。

γ氨基丁酸（GABA）与谷氨酸是一对重要的抑制与兴奋性神经递质，两者的平衡对维持脑功能至关重要。细胞外液GLU浓度过高，对脑有损伤作用因改变血脑屏障通透性，从而导致脑组织损害。如果谷氨酸代谢发生改变，势必会造成中枢神经激发兴奋性中毒，所以在谷氨酸代谢过程中，起到重要作用的谷氨酸转运体基因家族对于保护中枢神经系统有其重要的作用。谷氨酸转运体基因家族包括：谷氨酸/天门氨酸转运体基因（GLAST）、谷氨酸转运体基因－1（GLT-1）、兴奋性氨基酸转运体基因－3（EAAT3）、兴奋性氨基酸转运体基因－4（EAAT4）和兴奋性氨基酸转运体基因－5（EAAT5）。Niwako（2006）等利用直接测序的方法，在犬GLT-1基因的编码区发现了同义突变，分别统计了5个品种193只犬的基因型频率，发现品种之间基因型频率品种之间差异显著。本文选择谷氨酸/天门氨酸转运体基因（GLAST）和谷氨酸转运体基因－1（GLT-1）两个基因系统作为犬行为候选基因，旨在希望获得与犬行为密切相关的SNP位点，为以后犬早期辅助选择和犬指导训练奠定一定的理论基础。

一、材料和方法

（一）试验动物及采样

实验犬来自公安部南昌警犬基地，均为成年犬。品种有德国牧羊犬60条和罗维纳犬68条 (表1-1)，所有实验犬前肢静脉采血5ml，EDTA抗凝，-20℃保存。

表1-1 实验犬的品种、样本数，性别和年龄

（二）基因组DNA提取及纯度检测

血液中基因组DNA提取采用酚/仿法进行提取，用Pharmacia DNA/RNA浓度测定仪测定基因组DNA浓度和纯度，OD260 nm与OD280 nm吸收比值在1.8～2.0范围的DNA样品纯度较高。用1%琼脂糖凝胶电泳分析，DNA电泳条带为整齐、清晰的单一条带。调整DNA终浓度至50 ng/μl，样品保存于-20℃备用。

（三）序列扩增和多态性分析

参考NCBI提交犬的GLT-1和GLAST基因的全序列，分别在其3'-UTR区域设计一对引物（表5-1）。

PCR反应体系均为：10×Buffer1μl，25mmol/LMgcl20.6μl，10mmol/LdNTP 0.6μl，10mmol/L引物各0.5μl，Taq酶0.5U，50ng/μl DNA模板1μl，ddH2O 6.3μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火 45s，72℃延伸60s，35个循环后于72℃延伸10min，4℃保温。

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收克隆，并送北京三博公司测序。对测序结果利用NCBI在线比对软件Blast进行比对寻找突变位点。

（四）行为测试

测试地点在公安部南昌警犬基地，测试时间为2005年9～11月。根据Miller (1985)、Hart (1985) 和Bradshaw (1996)等的测试程序 （Hart B L & Hart L A，1985；Hart & Miller，1985；Bradshaw et al，1996），根据南昌警犬基地的实际情况，适当做了一些可行合理的修改。把每个行为性状均分成4个等级，共定义了48个行为变量。根据在犬行为测试过程中，犬的具体行为表现给予评分。

（五）统计分析

应用SAS的GLM过程构建一般线性模型计算不同基因型的行为参数的最小二乘均数和标准误，并进行显著性检验和多重比较。构建模型如下：

表5-1 用于扩增基因组序列及PCR-RFLP的引物

yijklm=μ+Gh+Bi+Sj+Ak+eijklm

yijkl为性状观察值

μ为分析性状的群体均值

Gh为三种基因型

Bi为品种效应，固定效应

Gj为性别效应，固定效应

Ak为年龄效应，固定效应

eijklm为随机残差效应

建立单标记回归统计模型，计算基因加性效应和显性效应。性状观察值＝群体平均值＋基因加性效应＋基因显性效应＋品种效应＋性别效应＋随机残差效应。加性效应用-1、0和1分别代表AA、AB和BB基因型；显性效应用1、-1和1分别代表AA、AB和BB基因型。

二、实验结果

（一）序列比对

对扩增的所有序列琼脂糖检测以后，回收、克隆和测序。对测序结果利用NCBI在线比对软件Blast进行序列比对。结果在GLT-1基因3'-UTR区域的第2170位发现了一个T/C突变，第2227位发现了一个A/T突变（见图5-1）；在GLAST基因3'-UTR区域发现了两个突变位点：第2648位点的T/A突变和第2652位点的G/A突变（见图5-2），在GLAST内含子上发现了3个突变位点（见图5-3）。

（二）基因分型

1. GLT-1 （T2170C）位点的基因分型

由于该突变没有引起酶切位点的改变，利用dCAPS Finder 2.0 program引入BsiYI酶切位点进行了基因分型。根据GLT-1（T2170C）引入引物进行序列扩增以后，扩增产物长为128bp，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，特异性好。经BsiYI酶切以后：TT基因型为：128bp，一条带；TC基因型为：128bp，111bp，17bp，三条带；CC基因型为：111bp，17bp。但是由于17bp在电泳图没有显出。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（见图5-4）。

2. GLAST （T2648A）位点的基因分型

由于该突变没有引起酶切位点的改变，同样利用dCAPS Finder 2.0 program引入SspI酶切位点进行了基因分型。根据GLAST（T2648A）引入引物进行序列扩增以后，扩增产物长为157bp，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，特异性好。经BsiYI酶切以后：TT基因型为：157bp，一条带；AT基因型为：157bp，133bp，24bp，三条带；AA基因型为：133bp, 24bp。但是由于24bp在电泳图没有显出。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（见图5-5）。

3. GLAST （G2652A）位点的基因分型

由于该突变没有引起酶切位点的改变，利用dCAPS Finder 2.0 program 引入BsiYI酶切位点进行了基因分型。根据GLAST（T2648A）引入引物进行序列扩增以后，扩增产物长为498bp，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，特异性好。由于该片段本身有两个酶切位点，经BsiYI酶切以后: AA基因型为：249bp, 128 bp，121bp三条带；GA基因型为：249bp，224 bp, 128bp，121bp，25bp, 五条带；GG基因型为：224 bp, 128bp，121bp，25bp, 四条带。但是由于25bp在电泳图没有显出。2.0 %的琼脂糖凝胶电泳（见图5-6）。

（三）三个基因位点在两犬品种基因型和基因型频率分布

由表5-2可知：GLT-1(T2270C) 位点在德国牧羊犬中不存在多态性，所有个体均为TT基因型，而罗维纳犬中，该位点的T等位基因和C等位基因几乎平衡，分别为：52.2%和47.8%；GLAST(T2648A) 位点在两个品种中，T等位基因均占有优势地位，分别为72.5%和62.5%，且AA基因型个体在两个品种均较少，分别为5%和3%；而GLAST(G2652A) 位点在两个品种中，A等位基因均占有优势地位，分别为：81.7%和70.6%。

（四）三个基因位点对犬行为性状的影响

利用SAS统计软件分析以后，数据显示：GLT-1(T2170C) 对犬的食欲反射强度、自由反射强度和兴奋性强度影响显著，其中TT基因型个体的食欲反射强度明显高于CC基因型个体（p<0.05），TC基因型个体的自由反射强度明显高于TT基因型个体（p<0.05），而TC基因型个体的兴奋转抑制速度要高于TT基因型个体；GLAST(T2648A) 多态位点对犬的外抑制强度及超限抑制强度影响显著，AA基因型个体的外抑制强度明显高于TT基因型个体（p<0.001），TT基因型个体的超限抑制强度高于AA基因型个体（p<0.05）；而GLAST (A2652G) 多态位点对犬的分化抑制强度影响显著，其中AA基因型个体的分化抑制强度低于AG型个体和GG型个体。

三、分析与讨论

细胞外液谷氨酸浓度过高，对脑有损伤作用（因改变血脑屏障通透性，从而导致脑组织损害）。如果谷氨酸代谢发生改变，势必会造成中枢神经激发兴奋性中毒，所以在谷氨酸代谢过程中，起到重要作用的谷氨酸转运体基因家族对于保护中枢神经系统有其重要的作用。国外，有些研究小组已经开始利用直接测序方法，来分析谷氨酸转运体基因家族多态性和犬行为之间的联系。

本实验对犬的两个最主要的谷氨酸转运体基因：GLT-1和GLAST，利用分子生物学的方法进行多态性分析，结果在GLT-1基因3'-UTR区域的第2170位发现了一个T/C突变，第2227位发现了一个A/T突变；在GLAST基因3'-UTR区域发现了两个突变位点：第2648位点的T/A突变和第2652位点的G/A突变，在GLAST内含子上发现了3个突变位点在GLAST基因。

GLT-1(T2270C) 位点在德国牧羊犬中不存在多态性，所有个体均为TT基因型，这说明C等位在德国牧羊犬这个品种上，在选择育种的过程中具有较好的选择压力；利用SAS统计软件分析以后，数据显示：TT基因型个体的食欲反射强度明显高于CC基因型个体（p<0.05），TC基因型个体的自由反射强度明显高于TT基因型个体（p<0.05），而TC基因型个体的兴奋转抑制速度要高于TT基因型个体，综合说明：T等位基因在犬行为个体中是一个相对有利的等位基因。

表5-2 三个基因位点在两犬品种基因型分布、基因频率及杂合度

表5-3 三个基因位点不同基因型犬的各种行为性状最小二乘值及基因效应

GLAST(T2648A) 位点在两个品种中，T等位基因均占有优势地位，分别为72.5%和62.5%，且AA基因型个体在两个品种均较少，分别为5%和3%；数据显示：该多态位点对犬的外抑制强度及超限抑制强度影响显著，AA基因型个体的外抑制强度明显高于TT基因型个体（p<0.001），TT基因型个体的超限抑制强度高于AA基因型个体p<0.05），说明该位点可能会影响犬的外抑制强度及超限抑制强度。

GLAST(G2652A) 位点在两个品种中，A等位基因均占有优势地位，分别为：81.7%和70.6%，且AA基因型个体的分化抑制强度低于AG型个体和GG型个体，。

由于本实验中，三个多态位点均在基因的3－UTR，随着对基因表达调控机制的深入认识, 真核mRNA 3－UTR在基因表达调控中的作用日益受到关注. 现已阐明, 它不仅调控mRNA的体内稳定性及降解速率, 控制其利用效率,协助辨认特殊密码子等, 而且还调控特定mRNA的翻译时间、位点及产物。

（作者单位：徐黎、叶俊华、杨前勇、马长书 、付平峰，公安部南昌警犬基地，330100；李德贵、杨利国，华中农业大学动物科学院，430070）

（编辑：李 冰）