肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种的分离鉴定及产乳酸研究

熊元林,阳 晗,刘雯雯,丁泽琴

（武汉生物工程学院生物工程系,湖北武汉 430415）

肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种的分离鉴定及产乳酸研究

熊元林,阳 晗,刘雯雯,丁泽琴

（武汉生物工程学院生物工程系,湖北武汉 430415）

从传统泡菜中分离出27株乳酸菌,经过初筛和复筛得到产乳酸量较高的菌株PC09,经鉴定该菌属肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostocmesenteroidessubsp.dex tranicum）;从番茄汁添加与否、发酵温度、转速、接种量等方面对 PC09产酸条件进行了研究。结果表明,在添加1%（体积分数）番茄汁、发酵温度为33℃、转速为100 r·min-1、接种量为2.0%的最佳产酸条件下,产酸量达到4.17%。

泡菜;乳酸菌;乳酸;发酵;正交实验

乳酸菌是重要的益生菌种,其发酵产物乳酸是重要的生物化工产品,广泛应用于食品酿造、生物制药、卷烟、皮革、印染、化工、农业等领域[1,2]。由L2乳酸合成的聚乳酸是替代塑料的理想材料[3,4]。

目前,国内外乳酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法[5]。作者从泡菜中分离出27株乳酸菌,从中筛选出一株产乳酸较多的菌种,经鉴定为肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex tranicum）,对其发酵产乳酸的条件进行了研究。为发酵法生产乳酸提供了理论依据,并且丰富了发酵法产乳酸的菌种。

1 实验

1.1 材料与试剂

新鲜泡菜汁。

革兰氏染色液,BTB2MR试剂等。

1.2 培养基

分离培养基[6]：M RS培养基、APT培养基、SL培养基、HP培养基、蔗糖硫胺培养基等。

鉴定培养基[6]：PY培养基。

发酵培养基[7]：葡萄糖 50 g,蛋白胨5 g,乙酸钠5 g,M gSO4·7H2O 0.2 g,吐温280 1 m L,M nSO4·H2O 0.0076 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 0.01 g,ZnSO4·7H2O 0.2 g,蒸馏水 1 L,调 p H 值 5.9～6.7,115℃灭菌30 min。

1.3 菌种的分离纯化

采用夹层平板法分离乳酸菌。样品稀释后涂于MRS2CaCO3培养基,迅速倒入5 m L冷却至 45℃的半固体培养基,形成双层平板,以隔绝空气;培养后用接种针划开表层琼脂,将菌落在平板上划线分离,同样覆盖一层半固体培养基。

1.4 菌种的鉴定

按文献[6]方法进行乳酸菌鉴定。

1.5 乳酸含量的测定

采用EDTA定钙法测定发酵液中乳酸的含量[8]。

1.6 发酵产酸条件的优化

从蕃茄汁添加与否、发酵温度、转速、接种量等方面进行单因素实验,确定较适宜的发酵条件。根据单因素实验结果,以发酵温度、转速、接种量为考察因素、以产酸量为考核指标,进行L9（34）正交实验,以确定最佳发酵条件。

2 结果与讨论

2.1 菌种分离鉴定

2.1.1 菌种分离结果

从泡菜汁中分离纯化得到27株乳酸菌,分别编号为PC01～PC27。根据平板上CaCO3溶解圈的大小进行初筛,然后摇瓶复筛,得到产酸量较高的菌株PC09。

2.1.2 PC09菌株鉴定结果

生物学特性：细胞球形,呈链状,革兰氏阳性,不运动,无芽孢,兼性厌氧,接触酶阴性,不产生吲哚,无还原硝酸盐能力,不能在p H值4.8以下生长,能发酵蔗糖产葡聚糖,菌落光滑圆整,乳白色。PC09发酵碳水化合物产酸实验结果见表1。

表1 PC09菌株发酵碳水化合物的结果Tab11 Fermentation results of carbohydrates by PC09

根据文献[6],判定PC09菌株为肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex t2ranicum）。

2.2 添加番茄汁对PC09发酵产酸的影响

在基础发酵培养基中添加1%（体积分数,下同）番茄汁进行发酵,测定产酸量,并与不加番茄汁的发酵产酸量进行比较,结果见图1。

图1 番茄汁对PC09发酵产酸的影响Fig.1 Effect of tomato juice on fermentation of PC09

由图1可以看出,发酵培养基中添加1%的番茄汁有利于PC09产生乳酸。主要是由于番茄汁中含有大量生长因子而有利于该菌的生长及产酸。

2.3 发酵温度对PC09发酵产酸的影响

在添加1%番茄汁的基础上,分别于27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃进行发酵 ,测定产酸量 ,结果见图2。

由图2可以看出,发酵温度为35℃时,产酸量最大。

2.4 转速对PC09发酵产酸的影响

在添加1%番茄汁、35℃条件下,分别采用60 r·m in-1、80 r·min-1、100 r·m in-1120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1转速进行发酵 ,测定产酸量,结果见图3。

图2 发酵温度对PC09发酵产酸的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on fermentation of PC09

图3 转速对PC09发酵产酸的影响Fig.3 Effect of rotating speed on fermentation of PC09

由图3可以看出,转速为100 r·m in-1时,产酸量最大。

2.5 接种量对PC09发酵产酸的影响

在添加1%番茄汁、35℃、100 r·min-1的条件下,分别采用 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的接种量进行发酵,测定产酸量,结果见图4。

图4 接种量对PC09发酵产酸的影响Fig.4 Effect of inoculum amoun t on fermen tation of PC09

由图4可以看出,接种量为2.0%时,产酸量达到最大。

2.6 正交实验结果

根据单因素实验结果,以发酵温度、转速、接种量为考察因素,每个因素选择3个水平,以产酸量为考核指标进行正交实验。因素与水平见表2,结果与分析见表3。

表2 正交实验因素与水平Tab12 Factorsand levels of orthogonal experiment

表3 正交实验结果与分析Tab13 Resultsand analysis of orthogonal experiment

由表3可以看出,各因素对产酸量影响大小依次为B>A>C,即转速对 PC09产酸影响最大。这可能是因为肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种属于兼性厌氧微生物,高浓度氧气反而对其产酸不利。最优组合为A1B2C2,即发酵温度33℃、转速100 r·min-1、接种量2.0%,此时产酸量达到4.17%。

2.7 讨论

（1）夹层平板法是分离纯化乳酸菌的较好方法,主要是因为乳酸菌多数属于厌氧或兼性厌氧;少数属于微好氧,上层半固体琼脂一方面能隔绝空气,另一方面也不妨碍菌种挑取。

（2）由于乳酸菌多数为厌氧微生物,所以发酵过程中摇瓶转速不宜过快。

3 结论

从传统泡菜中分离出27株乳酸菌,经过初筛和复筛得到产乳酸量较高的菌株PC09,经鉴定该菌属肠膜状明串珠菌葡聚糖亚种,在添加1%番茄汁、发酵温度为33℃、转速为100 r·min-1、接种量为2.0%的最佳产酸条件下,产酸量达到4.17%。

[1] Litchfield J H.Microbiological production of lactic acid[J].Adv Appl Microbiol,1996,42：45295.

[2] 杨洁斌,郭兴华,张篪.乳酸菌-生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版社,1996：2032206.

[3] 金其荣,张继民,徐勤.有机酸发酵工艺学[M].北京：中国轻工业出版社,1997：3392340.

[4] H.G施莱杰（德国）,著.陆卫平,周德庆,郭杰炎,等译.普通微生物学[M].上海：复旦大学出版社,1990：2672275.

[5] 陈俊亮,杨丽杰,霍贵成.产α2半乳糖苷酶乳酸菌的鉴定及其发酵性能研究[J].山东大学学报,2008,43（7）：28232.

[6] 凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社,1999：54257,842108.

[7] 田丰伟,丁虎生,丁纳,等.产胞外多糖的乳酸菌的简便筛选与鉴定[J].食品与发酵工业,2008,34（3）：15219.

[8] 杨雪,陶兴无,高冰,等.发酵大头菜中乳酸菌的分离鉴定及生产初试[J].中国酿造,2008,（5）：31233.

Isolation,Iden tification of Leuconostoc M esenteroides Subsp.Dextranicum and Study on Acid2Production Conditions

XIONGYuan2lin,YAGN Han,L IUWen2wen,D ING Ze2qin
（Department of B ioengineering,W uhan B ioengineering Institute,W uhan430415,China）

Total 27 strains of lactic acid bacteria were isolated from home2made pickles.After screening and re2 screening,strain PC09 producing higher amountof lactic acid wasobtained and determined asLeuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum.The acid2p roduction conditions for PC09 such as the tomato juice adding or not,fermentation tem2 perature,rotating speed,inoculum amount were studied.The results showed that the acid2p roduction reached 4.17%under the optimum conditions as follow s：adding 1%tomato juice,fermentation temperature 33℃,rotating speed 100 r·min-1and inoculum amount 2.0%.

pickles;lactic acid bacterium;lactic acid;fermentation;o rthogonal experiment

Q 93919 TS 201.3

A

1672-5425（2010）06-0059-03

武汉生物工程学院校基金资助项目（200704）

2010-03-16

熊元林（1978-）,男,湖北麻城人,硕士,讲师,研究方向：应用微生物。E2mail：coolice2hust@sohu.com。