Mn2+对肠膜状明串珠菌产右旋糖酐的影响

问清江，慕 娟，孙晓宇，丁 浩

(陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043)

肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)能够以蔗糖为碳源产生右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase,EC 2.4.5.1)，该酶是一种葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferases)，可以蔗糖为底物，将蔗糖分子中的D-吡喃葡萄糖基催化转移到葡聚糖分子中，可以生成不同分子量的右旋糖酐(α-葡聚糖)，同时生成果糖[1-3]。右旋糖酐是α-葡聚糖，是若干葡萄糖脱水形成的高分子聚合物，主要由α-1,6糖苷键连接而成[4]。右旋糖酐安全、无毒，且结构疏松柔软，具有较好的水溶性及持水性，被广泛应用于医药、食品、色谱分析、石油工业等领域[5]。在研究金属离子对肠膜状明串珠菌Lm-1226产右旋糖酐发酵影响中发现，Mn2+对发酵液中的果糖和右旋糖酐两种代谢产物的影响结果不同。因此研究Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226产右旋糖酐的影响，首先研究Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226生长的作用，然后是Mn2+对发酵中果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶产生的影响，最后是Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响。对作用机理进行了初步探索，为现行的右旋糖酐发酵生产及未来右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐提供参考，另外当有类似于Mn2+等具有氧化还原性物质存在时，利用氧化还原反应检测代谢产物就会对检测结果产生影响，在遇到具体问题应考虑影响的存在，并改进方法消除影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Leuconstocmesenteriodes-1226 (Lm-1226)(中国药品生物制品检定所)。

1.1.2 培养基(g/L) 白砂糖120，蛋白胨 1.7，磷酸氢二钠1.4，pH 7.0。

1.1.3 试剂与仪器 果糖(D-(-)-fructose),Sigma 公司产品；3,5-二硝基水杨酸(DNS),化学纯；其他试剂为市售分析纯；白砂糖(市售一级)。722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；SPX-150BIII生华培养箱；GH-500型隔水式培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226生长的影响 采用比浊法测定菌体生物量，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同浓度将氯化锰加入液体培养基中，不加氯化锰为对照，将肠膜状明串珠菌Lm-1226接入，25 ℃静止培养24 h，于600 nm下测OD值。

1.2.2 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖的影响 保持发酵培养基的其他成分不变，以1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同浓度将氯化锰加入发酵培养基中，不加氯化锰为对照，将种子培养液以10%的接种量接入发酵培养基，25 ℃静止培养24 h，测定发酵液的果糖。

1.2.3 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐的影响 保持发酵培养基的其他成分不变，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同浓度将氯化锰加入发酵培养基中，不加氯化锰为对照，将种子培养液以10%的接种量接入发酵培养基，25 ℃静止培养24 h。将75%乙醇按135 mL/100 mL发酵液加入到发酵液中，充分搅拌均匀，放置，收集沉淀，沉淀用75%乙醇洗涤3次，烘干为右旋糖酐。

1.2.4 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶的影响 保持发酵培养基的其他成分不变，以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L不同浓度将氯化锰加入发酵培养基中，不加氯化锰为对照，将种子培养液以10%的接种量接入发酵培养基，25 ℃静止培养24 h，测定发酵液右旋糖酐蔗糖酶活力。

1.2.5 Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响 右旋糖酐发酵液进行一定的稀释，10 000 r/min离心15 min，收集上清液为右旋糖酐蔗糖酶酶液，在适当稀释的酶液中加入2.5、5.0、7.0、10.0、12.5、15.0 mmol/L不同浓度的Mn2+，以蔗糖为底物，右旋糖酐蔗糖酶在Mn2+浓度为1.25、2.5、3.5、5.0、6.25、7.5 mmol/L不同反应体系中作用，测定酶活力，以确定Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响。

1.2.6 果糖和右旋糖酐蔗糖酶活力测定[6]采用DNS法测定右旋糖酐蔗糖酶活力。配制1 mg/mL果糖标准溶液，分别量取0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL果糖标准溶液，用蒸馏水补齐1.0 mL，再加入2.0 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷却后加蒸馏水至10 mL，在540 nm测定光吸收值，绘制果糖标准曲线，得出回归方程用于果糖和酶活的测定。将发酵液用蒸馏水适当稀释为待测样品，取1.0 mL样品，加入2.0 mL DNS溶液，沸水浴2 min显色，其余同果糖标准曲线，发酵液相对应的发酵培养基同样品测定作为空白对照(Mn2+与DNS发生反应)，以蒸馏水为对照测定540 nm的吸光值，样品和空白对照的吸光值之差根据回归方程得出发酵液中的果糖量。将酶液用pH 5.4的0.2 mol/L醋酸缓冲液适当稀释后，取0.5 mL的稀释酶液加入0.5 mL 10%的蔗糖溶液中，25 ℃准确反应1 h，加入2 mL DNS终止反应，沸水浴2 min显色，然后流水冷却至室温，定容至10 mL；空白对照的酶液和DNS加入顺序颠倒，其余同样品测定。以蒸馏水为对照测定540 nm的吸光值，样品和空白对照的吸光值之差根据回归方程得出反应液中的果糖量，从而确定酶活。酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟催化蔗糖产生1 μmol果糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

2 结果与分析

2.1 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226生长的影响

以不同Mn2+浓度将氯化锰加入培养基中，肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长结果见图1。随着Mn2+浓度的增加，发酵液中Lm-1226菌密度先增长，当Mn2+浓度为0.6 mmol/L时，菌密度最大，且大于对照，随后菌密度急剧下降。结果表明，一定浓度的Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长具有促进作用。

图1 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226生长的影响Fig.1 The effect of Mn2+ on Lm-1226 growing

2.2 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵的影响

2.2.1 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖的影响 在发酵培养基中按不同Mn2+浓度加入氯化锰，对发酵液中的果糖进行测定，结果见图2。含有Mn2+的发酵液中果糖量均低于对照组，且随着Mn2+浓度的增加，发酵液中的果糖含量逐渐降低，说明Mn2+抑制肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖，且Mn2+浓度越高，抑制性越强。

图2 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖的影响Fig.2 The effect of Mn2+ on fructose production of Lm-1226

2.2.2 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐的影响 在不同浓度Mn2+发酵培养基中发酵培养肠膜状明串珠菌Lm-1226，对发酵液中的右旋糖酐进行乙醇沉淀分离提取，从图3可以看出，加入Mn2+的发酵液与对照组相比，右旋糖酐的产量急剧下降，且随着Mn2+浓度的增加，继续逐渐降低。Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐具有较强的抑制作用。

图3 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐的影响Fig.3 The effect of Mn2+ on dextran production of Lm-1226

2.2.3 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶的影响 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶的作用结果表明(图4)，发酵培养基中加入Mn2+的右旋糖酐蔗糖酶活力均低于对照组，但是不同Mn2+浓度对产酶水平的影响有所不同，0.2～0.6 mmol/L右旋糖酐蔗糖酶活力先增高，0.4 mmol/L时相对最高；其后呈现下降趋势，0.6～1.0 mmol/L酶活力基本不变；随后又下降，3.0～7.0 mmol/L酶活力基本不变；之后酶活力大幅度下降。总之，与对照相比较Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用。

图4 Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶的影响Fig.4 The effect of Mn2+on dextransucrase production of Lm-1226

2.3 Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响

肠膜状明串珠菌Lm-1226产生的右旋糖酐蔗糖酶在不同Mn2+浓度的反应体系中作用结果见图5，在1.25～7.5 mmol/L Mn2+浓度范围内，右旋糖酐蔗糖酶作用开始随着Mn2+浓度的增加而增强，5.0 mmol/L时作用最强，为对照的158%；随后增强作用逐渐降低，但是酶的作用均高于对照。Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶具有较强的激活作用，最适Mn2+浓度为5.0 mmol/L。

图5 Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响Fig.5 he effect of Mn2+ on dextransucrase

3 讨 论

肠膜状明串珠菌发酵生产右旋糖酐在我国具有几十年的历史，但是相关企业主要采用半无菌发酵工艺，其缺点是产率低、产品质量差，后续药用右旋糖酐产品的用药安全存在隐患。为了解决这一问题，对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵条件进行优化研究，在金属离子对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵影响实验中发现，果糖随着Mn2+浓度的增加一直呈现上升趋势，而右旋糖酐则是下降趋势；在发酵液右旋糖酐蔗糖酶活力测定时，空白对照的光吸收值随着Mn2+浓度的增加而增加。这是由于Mn2+具有氧化还原性，对DNS测定果糖因Mn2+自身与DNS发生反应而影响到检测结果，为此将DNS测定果糖方法进行改进，消除Mn2+自身的影响。因此在应用DNS测定还原糖时，要考虑到样品中是否含有具有还原性的其他物质，若有类似Mn2+的还原性物质，则需要改进检测方法，消除其对还原糖检测结果的影响。对Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长，发酵产果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶作用影响进行了研究，结果表明，一定浓度的Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长具有促进作用；Mn2+抑制肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖和右旋糖酐，且Mn2+浓度越高，抑制性越强； Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用,该抑制作用与Mn2+浓度增大所呈现变化趋势与果糖和右旋糖酐产生的不同，不是一直随Mn2+的增大而增强，而是有波动，可能与Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶的作用有促进作用相关；Mn2+对右旋糖酐蔗糖酶具有较强的激活作用，激活作用可达158%，最适Mn2+浓度为5.0 mmol/L。根据这一研究结果，在肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐过程中，种子培养基中加入Mn2+有助于Lm-1226的生长；应用右旋糖酐蔗糖酶转化蔗糖合成右旋糖酐中加入Mn2+，可以促进右旋糖酐蔗糖酶的作用，提高蔗糖的转化率和右旋糖酐的产率。Mn2+对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵的影响仅仅进行了初步研究，其作用机理有待于进一步研究和探索。