桑蚕蛹中高纯度α－亚麻酸的分离研究

鲁仲辉潘秋月孟祥河孙培龙

(浙江工业大学生物与环境工程学院1，杭州 310014)

(浙江经贸职业技术学院应用工程系2，杭州 310018)

桑蚕蛹中高纯度α－亚麻酸的分离研究

鲁仲辉1潘秋月2孟祥河1孙培龙1

(浙江工业大学生物与环境工程学院1，杭州 310014)

(浙江经贸职业技术学院应用工程系2，杭州 310018)

为获得高纯度蚕蛹α－亚麻酸，研究采用了尿素脂肪酸包合结合银离子硅胶色谱技术分离。结果表明，脂肪酸/尿素质量比对包合效果的影响最重要，尿素浓度、结晶温度和时间的影响其次。当脂肪酸/尿素(质量比)为0.3，尿素质量分数为30%，0℃结晶2 h，α－亚麻酸质量分数从初始的32.53%提高到83.56%。二次尿素结晶包合提高α－亚麻酸纯度的效果并不明显，反而α－亚麻酸回收率明显下降。对一次包合富集的产物采用银离子硅胶色谱柱进一步纯化，α－亚麻酸纯度提高至近100%，回收率86.2%。因此采用尿素包合结合银离子硅胶色谱分离高纯度蚕蛹α－亚麻酸是可行的。

α－亚麻酸 桑蚕蛹 纯化 尿素包合 银离子色谱

α－亚麻酸(ALA)即9c，12c，15c—十八碳三烯酸，作为ω3系多不饱和脂肪酸具有显著的药理作用和营养价值［1－2］。此外，α－亚麻酸是人体必需脂肪酸，只能从外源食物中摄取。体内可转化为EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)，在降血脂、降血压、抗血栓、抗癌、抗过敏等方面都可发挥重要作用［3－4］。目前，α－亚麻酸在医药、食品、化妆品等领域应用广泛。主要来源于紫苏油、黑加仑籽油、胡麻籽油、亚麻籽油、接骨木油等小油料。上述原料的主要问题是或产量低或来源不稳定，因而成本较高。蚕蛹作为桑蚕业缫丝副产物，产量大，成本低，来源稳定，其蛹油中α－亚麻酸质量分数约为30%，是较为经济的α－亚麻酸原料。本研究采用尿素包合法结合银离子络合色谱技术分离高纯度的α－亚麻酸。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑蚕蛹:浙江农业科学院;脂肪酶:无锡雪酶酶制剂有限公司;亚麻酸标准品:美国Sigma公司;硅胶(100～120目，表面积127.85 m2/g):青岛海洋化工厂分厂;其他试剂均为分析纯。

KQ－300GVDV型三频恒温数控超声波反应器:昆山超声仪器厂;刮膜式分子蒸馏设备:美国Pope公司;6890 GC配氢火焰离子化检测器:美国Agilent公司;SP－2340键合硅胶毛细管柱(60 m×0.32 mm，i.d.0.2 μm):美国Supelco公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蚕蛹油萃取

取新鲜蚕蛹真空干燥(70℃，13.33 kPa，2～3 h)，使含水量小于8%，然后破碎至100目。用正己烷(料液比1∶15)超声波辅助萃取20 min，过滤取清液。重复萃取2次合并萃取清液，真空旋转蒸发脱溶剂至恒重得试验用油，粗脂肪得率30%。

1.2.2 蛹油混合脂肪酸的制备

称取适量蚕蛹油，配成20%的水溶液，水浴预热至40℃，加入油质量5%的脂肪酶，水浴中搅拌(500 r/min)水解5 h，定期测水解度。结束后过滤，静置分相。油相用0.8%氯化钠水溶液洗3次，然后无水硫酸钠干燥，最后分子蒸馏(真空度30～50 Pa，190℃)除杂质，取轻相作为后续尿素包合的原料。蚕蛹油水解率为95.3%，蒸馏后的混合脂肪酸组成与原料基本相同。

1.2.3 尿素包合方法

将尿素加入一定量乙醇中，65℃水浴中搅拌溶解，按比例加入一定量混合脂肪酸，20～30 r/min搅拌30 min，取出冷至室温。于设定温度下包合一定时间，取出后迅速减压抽滤，用少量包合温度下的冷乙醇洗涤结晶，滤液用10%盐酸调至pH 2.5，转移至分液漏斗中，用正己烷30 mL萃取，弃水层，重复萃取两次，合并油相水洗至中性，然后无水硫酸钠干燥，40℃真空旋转蒸发脱溶剂，最后氮气吹干，准确称重，得到富集的α－亚麻酸。α－亚麻酸回收率根据富集物中亚麻酸占起始原料亚麻酸质量的百分比计算。

1.2.4 银离子色谱络合吸附亚麻酸的方法

50 g硅胶分散在乙醇中(20 mL，10 min)，加入150 mL硝酸银乙醇溶液(5 g硝酸银溶于150 mL 70%乙醇中)连续搅拌10 min，在氮气保护下水浴蒸干乙醇，然后80℃干燥过夜，激活银离子硅胶，得到自由流动的吸附银离子的硅胶粉末。冷却盛于棕色瓶中干燥保藏。湿法装柱(玻璃色谱柱19 mm×30 cm，填充高度5 cm。取1.0 mL混合脂肪酸乙脂，溶于5 mL正己烷中，加入吸附柱，先用50 mL正己烷洗脱除去未被吸附的脂肪酸和饱和脂肪酸，然后用正己烷/丙酮(99∶1)洗脱单不饱和脂肪酸，最后用50 mL丙酮洗脱亚麻酸，流速2 mL/min。每50 mL收集一个馏分，GC分析 α－亚麻酸含量，计算回收率。

1.2.5 脂肪酸组成的GC法分析

混合脂肪酸甲酯化采用BF3/甲醇法。甲酯分析采用安捷伦6890系列GC/FID检测，SP－2340键合硅胶毛细管柱，180℃恒温30 min。进样口及检测器温度分别为220℃和245℃，载气He，1.5 mL/min，分流比1∶30。各脂肪酸的含量采用归一化法。每个样品独立重复3次。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸/尿素对包合效果的影响

尿素包合物的形成与脂肪酸的本质有关。脂肪酸饱和度越高、碳氢链越长，越容易与尿素分子结合形成六菱形包合物。因此包合时，直链饱和的棕榈酸、硬脂酸容易形成包合物，而多不饱和脂肪酸如亚油酸、α－亚麻酸则在溶液中富集。因此包合后通过简单的过滤就可实现多不饱和脂肪酸的分离。然而，要得到较好的包合分离效果，适宜的脂肪酸/尿素质量比是重要的。不同脂肪酸/尿素条件下(尿素质量分数为30%，包合温度为4℃，时间为12 h)富集得到的脂肪酸组成及亚麻酸回收率分别如图1和图2所示。

图1 不同脂肪酸/尿素下富集产物的脂肪酸组成

显而易见，随脂肪酸/尿素增加，尿素量逐渐不足以包合混合脂肪酸中的饱和脂肪酸，因此产物中亚麻酸质量分数下降明显(从87.92%降为44.18%)。就产物纯度来讲，脂肪酸/尿素为0.1时效果最好，此时棕榈酸、硬脂酸等饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸油酸的质量分数从原料中的22.42%、5.73%、32.79%分别降到1.01%、0.29%、4.29%，亚油酸含量变化不大(由4.37%降至4.29%)，多不饱和脂肪酸α－亚麻酸质量分数则从32.53%骤增至87.92%。但由于尿素过量，部分多不饱和脂肪酸也与尿素结合形成复合物，因此α－亚麻酸回收率仅为38.4%。包合物中的脂肪酸通过范德华力、色散力或静电相互作用与尿素结合维持稳定，包合物的形成完全取决于脂肪酸的性状、大小和几何形状［5］。α－亚麻酸的回收率趋势则与纯度不同，前期随脂肪酸/尿素增大而增加，脂肪酸/尿素为0.6时，α－亚麻酸回收率最高达94%，但α－亚麻酸纯度仅为52%。脂肪酸/尿素进一步增加，α－亚麻酸回收率、纯度均下降。这可能是由于脂肪酸载荷过大，结晶时α－亚麻酸被夹带损失所致。综合考虑，脂肪酸/尿素为0.3是较为合适的，此时，α－亚麻酸回收率为 72.5%，纯度83.56%，明显优于Ahmed等［6］采用尿素包合分离Mucor zychae脂质γ－亚麻酸的效果(γ－亚麻酸纯度为63.5%，回收率为68%)。此外，试验发现尿素包合富集α－亚麻酸时，亚油酸脱除难度最大。

图2 脂肪酸/尿素对α－亚麻酸回收率的影响

2.2 尿素浓度对包合效果的影响

理论上讲，脂肪酸/尿素等条件不变，仅改变尿素浓度并不会影响包合的选择性。但尿素浓度增加，提高了脂肪酸与尿素分子的碰撞几率，因此包合更容易实现。

图3 尿素浓度对包合效果的影响

由图3可以看出，尿素质量分数过低(20%、25%)尽管α－亚麻酸总回收率较高，但富集产物中α－亚麻酸含量较低。这应归因于尿素、脂肪酸浓度低，分子碰撞几率下降，因此包合效率下降。另一方面冷却时产生的尿素晶体减少，包合脱除饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸的能力下降。但尿素质量分数从30%提高至60%，尿素的包合选择性没有显著变化，所富集的α－亚麻酸质量分数均在80%以上，但脂肪酸/尿素是固定的，因此单位溶剂的脂肪酸载荷量显著增加，这对于工业生产的经济性是十分有利的。结合考虑α－亚麻酸回收率，试验确定尿素质量分数30%较为合适。

2.3 包合温度和时间对包合效果的影响

温度会影响尿素和脂肪酸的溶解度及结晶速度，因此会对包合效果产生重要影响。既定条件下(脂肪酸/尿素为0.3，尿素质量分数为30%，包合时间为12 h)，不同温度对包合效果的影响如图4所示。

图4 温度对包合效果的影响

数据差异显著性分析结果表明:－30～10℃范围内α－亚麻酸纯度及回收率均没有明显差别。但－40℃条件下亚麻酸的纯度显著降低(仅为40%左右)，含量差异达到极显著水平(P＜0.01)。这可能是由于－40℃低于乙醇中的α－亚麻酸的凝固点，因此脂肪酸和尿素同步凝固析出，使得包合的选择性急剧降低。时间对包合效果的影响趋势与温度相似，脂肪酸/尿素为0.3，尿素质量分数为30%，10℃下分别包合1、2、4、8、12、24 h，α－亚麻酸的纯度及回收率均没有显著性差异。因此综合考虑包合效果和经济性，试验确定包合温度为0℃，时间为2 h。

2.4 二次包合的效果

为进一步提高产物中α－亚麻酸的纯度，试验对包合富集的产物进行了二次包合。包合条件选择单因素获得的较优条件:尿素质量分数为30%，脂肪酸/尿素为0.3，包合温度为0℃，时间为2 h，试验结果如表1所示。数据显示相对于一次包合，二次包合效果并不明显，α－亚麻酸的纯度略有增加(一次包合为83.56%，二次包合为84.92%)，但亚油酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸脱除效果不佳。而二次包合的α－亚麻酸总回收率则从72%降至65%，由此可见采用二次脲包法提高α－亚麻酸的纯度效果并不理想。而Ahmed等［6］的结果显示，通过二次包合可将γ－亚麻酸的纯度由67%提高到99%。但二次包合脂肪酸回收率并未给出，估计其较高的亚麻酸纯度的获得是以大幅度牺牲亚麻酸回收率为代价实现的。

表1 包合前后脂肪酸的组成及含量

2.5 银离子色谱分离α－亚麻酸

由于二次包合不能有效脱除残余的亚油酸、油酸和微量棕榈酸、硬脂酸，本研究尝试银离子色谱对一次包合富集的产物进一步纯化。较优的试验结果列于表2中。

表2 银离子柱色谱各馏分的α－亚麻酸含量及回收率

数据显示不被银离子吸附的棕榈酸、硬脂酸等饱和脂肪酸及少量穿透的不饱和脂肪酸主要存在于石油醚相中，油酸和亚油酸主要被石油醚/丙酮(99∶1)洗脱。而吸附较强的α－亚麻酸被强极性的丙酮剥离，其产物中α－亚麻酸纯度接近100%，回收率86.2%，充分显示出银离子络合分离的高选择性。

3 结论

尿素包合分离蚕蛹α－亚麻酸工艺条件中，脂肪酸尿素质量比对包合效果影响最大，脂肪酸/尿素一定条件下，尿素浓度提高对包合选择性影响不大，但单位体积溶剂的载荷增加。－30～10℃包合2～4 h，对包合效果影响不显著。试验中二次尿素包合不能有效脱除低含量的亚油酸、油酸。相比之下，银离子硅胶色谱选择性更高，可使亚麻酸质量分数从80%提高到近100%。

［1］杨克迪，胡小明，黄海基，等.硝酸银络合萃取蚕蛹油α－亚麻酸酯［J］.中国油脂，2008，33(1):30－32

［2］刘静，张光华.β－环糊精包合法分离花椒油中的α－亚麻酸工艺研究［J］.中国调味品，2008(8):36－39

［3］刘峰，王正武，王仲妮.α－亚麻酸的分离技术及功能［J］.食品与药品，2007，9(8):60－63

［4］李婷婷，吴彩娥，许克勇，等.分子蒸馏技术富集猕猴桃籽油中α－亚麻酸的研究［J］.农业机械学报，2007，28(5): 96－99

［5］Sajilata M G，Singhal R S，Kamat M Y.Fractionation of lipids and purification of α－linolenic acid(GLA)from Spirulina platensis［J］.Food Chemistry，2008，109:580－586

［6］Ahmed U S，Reddy K K，Swathy S L，et al.Enrichment of αlinolenic acid in the lipid extracted from Mucor zychae MTCC 5420［J］.Food Research International，2009，42(4):449－453.

Isolation of α－Linolenic Acid from Bombyx mori L.Silkworm Chrysalis

Lu Zhonghui1Pan Qiuyue2Meng Xianghe1Sun Peilong1
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology1，Hangzhou 310014)
(Department of Application＆Engineering，Zhejiang Economic＆Trade Polytechnical2，Hangzhou 310018)

To obtain high purity alpha linolenic acid(ALA)from silkworm lipids，urea crystallization and argentated silica gel chromatography were employed in this work.Results suggested that fatty acid/urea ratio was the key factor for ALA purity and recovery，and urea concentration，crystallization temperature，and time are in the next place.When crystallization was carried at 0℃ for 2 h，with fatty acids/urea ratio of 0.3 and urea concentration of 32.53%，ALA percentage increased from 32.52%to 83.56%，and when the enriched lipid sample was subjected to urea crystallization for the second time，the concentration of ALA did not further increased，and the ALA recovery decreased significantly.However，when the enriched lipid was subjected instead to argentated silica gel chromatography (ASGC)，the ALA percentage increased to 100%，and ALA recovery was 86.2%.It is indicated that the isolation of high purity ALA from silkworm lipids by urea crystallization and then by ASGC is feasible.

α－linolenic acid，silkworm，purification，urea inclusion，argentated silica gel chromatography

TQ645.6 文献标识码:A 文章编号:1003－0174(2010)11－0074－04

浙江省科技厅项目(2007C32024)

2009－10－27

鲁仲辉，男，1982年出生，硕士，食品科学

孙培龙，男，1964年出生，博士生导师，多糖、脂类