酱油曲霉发酵芝麻饼粕中抗氧化物质提取条件的优化

邵元龙 董 英

(江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013)

酱油曲霉发酵芝麻饼粕中抗氧化物质提取条件的优化

邵元龙 董 英

(江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013)

采用正交设计和响应面的试验方法,对酱油曲霉发酵芝麻饼粕中的抗氧化物质的提取工艺进行了优化。结果表明,正交优化试验中,影响提取发酵芝麻饼粕中抗氧化物质因素的主次顺序为:乙醇体积分数 >液料比 >提取时间 >提取次数。通过响应面试验再优化,得到影响提取抗氧化物质因素的二次多项式数学模型方程为:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2。优化的提取条件为:提取时间 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇体积分数 61.3%,在此条件下,DPPH自由基清除率可达 81.5%。该结果为下一步对提取的抗氧化物质的分离和发酵机制的研究奠定了基础。

芝麻饼粕 酱油曲霉 优化 提取 抗氧化物质

在亚洲国家,芝麻广泛应用在各种传统食品中,并且是世界上重要的油料作物之一,我国 2007年的产量已达到59万吨。上世纪 90年代,逐渐重视芝麻中木脂素类物质的研究,这类物质是重要的抗氧化剂,具有多种生理功能[1-3]。木脂素约占芝麻的0.5%～1.0%,分为脂溶性和水溶性两类,如芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚等[4-9]。在提油过程中,部分木脂素转移到芝麻饼粕中,其提取方法和生理活性一直是研究的热点[10]。

单纯的分离和鉴定木脂素已不能满足未来对抗氧化剂的需求,应用现代生物技术方法寻找新抗氧化剂来源前景广阔。董英等[11]用酱油曲霉发酵芝麻饼粕,发现可以提高其抗氧化活性,对其提取条件并未深入探讨。因此,本试验仍选用该菌株对芝麻饼粕进行发酵,以抗氧化活性为指标,对提取条件再优化,为下一步对发酵芝麻饼粕中抗氧化物质的分离纯化和转化机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

酱油曲霉 (Aspergillus sojae),CI CC 2128:中国工业微生物菌种保藏中心;芝麻饼粕:江苏镇江京友调味品公司[12];二苯代苦味肼基自由基 (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):美国 Sigma公司。

HH-S恒温水浴锅:江苏金坛医疗仪器厂; Y M50A电热蒸汽压力灭菌器:上海三申医疗器械有限公司;PSX智能型恒温恒湿培养箱:宁波来福科技有限公司;WFJ-7200可见分光光度计:尤尼柯 (上海)仪器有限公司。

1.2 接种与发酵方法

酱油曲霉接种于土豆汁 (PDA)斜面培养基上, 28℃培养 72 h后,加入 10 mL无菌生理盐水,用接种针刮下,调节菌液浓度为 0.86×108cfu/mL。取烘干粉碎的芝麻饼粕,按料液比为 1:3的比例加入正己烷,45℃水浴搅拌 3 h,4 000 r/min离心 10 min,沉淀自然晾干,得脱脂芝麻饼粕。取 10 g烘干的脱脂芝麻饼粕加入9 mL蒸馏水,于121℃灭菌20 min,冷却后,接种 1 mL制备好的种子悬液,摇匀,于 28℃条件下发酵 144 h,72 h时摇匀一次,直至发酵结束。

1.3 提取工艺优化方法

1.3.1 正交优化试验设计

在多次单因子对比试验基础上,选择提取溶剂乙醇体积分数(A)、提取时间 (B)、总乙醇体积与芝麻饼粕质量比(液料比)(C)和提取次数 (D)4个因素,考察 4因素对自由基清除率的影响,试验因素水平见表 1。发酵结束后,按试验设计方案加入提取液,于 50℃水浴搅拌提取,转速 150 r/min。提取液于 5 000 r/min离心 10 min。上清液经浓缩或添加提取液,统一定容至 150 mL。对提取液的自由基清除率进行测定和分析。

表1 正交试验设计因素水平表

1.3.2 响应面优化试验设计

在探讨了乙醇体积分数、提取时间、液料比和提取次数对提取物抗氧化活性影响的基础上,优化出 3个主要的影响因素。根据 Box-Behnken中心组合试验设计原理,以提取时间、液料比、乙醇体积分数为自变量,自由基清除率为响应值,对这 3个因素进一步优化,设计了三因素三水平的响应面分析试验,试验的因素和水平取值见表 2。发酵条件和提取液处理条件与正交试验一致。

表2 响应面试验因素水平表

1.3 DPPH自由基清除率测定 (Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的发酵提取液 1 mL,用 50%的乙醇稀释10倍,作为样品液。DPPH溶液浓度为 7.5×10-6mol/mL,波长 517 nm,50%乙醇为对照。每个样品重复测定 2次,求平均值。

计算公式为:

式中:A0为 5 mL DPPH与 1 mL乙醇混合液的吸光度;Ai为 5 mL DPPH与 1 mL样品反应后的吸光度;Aj为 5 mL乙醇与 1 mL样品混合液的吸光度[13]。

2 结果和讨论

2.1 正交优化试验结果

从表 3可知,影响抗氧化物提取率因素的主次为A>C>B>D,即乙醇体积分数对提取率影响最大,其次为液料比和提取时间,最弱的为提取次数。乙醇体积分数为 60%时,提取物的平均自由基清除率为71.46%,大于 80%时的平均清除率为 69.02%,但无显著的差异,提取次数之间差异微弱。从提取过程可操作性及经济学考虑,提取溶液体积和浓度,都应尽可能减小,且采用单次提取。

表 3 正交试验设计L9(34)及结果

2.2 响应面优化试验结果

响应面试验设计和结果见表 4,对所得数据采用Desigh-Expert 7.0 Trial软件中的 RS(response sur2 face)程序进行分析,应用Model Graph程序作响应曲面图和等高线图。

表4 响应面试验设计和结果

经回归拟合,获得Aspergillus发酵芝麻饼粕提取物抗氧化活性对自变量提取时间、液料比和乙醇体积分数的二次多项回归方程为:

RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

模型方差分析见表 5,试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P<0.000 1),失拟项不显著(P =0.075 3)。所以自由基清除率与预测值之间具有较好的拟合优度,可用于Aspergillus固体发酵提取物抗氧化活性的分析和预测。从 3个因素对提取物抗氧化活性的影响来看,回归方程的一次项中B和 C对发酵提取物抗氧化活性的影响极显著(P<0.01),且影响能力B>C,即液料比 >乙醇体积分数,提取时间的线性影响不显著,各因素二次项A2、B2和 C2的影响也达到了极显著水平,交互作用项中仅 AC达到了显著(P<0.05)的水平。这也表明了响应值的变化复杂,不仅受单因素的影响,而且还存在交互作用。

表5 响应面试验设计方差分析表

对回归方程进行数学分析,可得到最大响应值所对应的提取条件,择优的提取条件为:提取时间120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇体积分数 61.3%,理论提取物抗氧化活性为 82.5%。为了验证该结果,按照该条件做 5次验证试验,结果分别为 79.24%、81.18%、82.39%、83.47%和 81.33%,平均值为81.5%,与理论值差异不显著,优化的结果有意义。

2.3 响应面的等高线图和曲面图

通过二次回归方程所作的响应曲面图及等高线图如图 1和图2。

图 1 时间和乙醇体积分数交互作用的等高线图及其曲面图

图 2 液料比和乙醇体积分数交互作用的等高线图及其曲面图

图 1显示了提取时间和乙醇体积分数对提取物抗氧化能力的影响效应。由图可知,两因素之间存在较强的交互作用,在试验条件范围内,随着提取时间的延长,乙醇体积分数的提高,提取物抗氧化活性迅速提高,达到一定值后,又明显下降。由图 2可知,乙醇体积分数和液料比均趋向于较大取值点时抗氧化活性较高。而时间和料液比的相互作用对提取物抗氧化能力的影响不显著。

3 结论

3.1 通过正交优化试验得出,影响从酱油曲霉发酵芝麻饼粕中提取抗氧化物质的各因素的主次顺序为:A>C>B>D,即乙醇体积分数对提取率影响最大,其次为液料比和提取时间,最弱的为提取次数。3.2 利用 Design expert设计软件,采用响应面分析法建立了从酱油曲霉发酵芝麻饼粕中提取抗氧化物质的提取工艺条件的二次多项式数学模型,并对各因素对响应值的影响进行了分析。拟合的考察因素与抗氧化活性之间的二次回归方程为:RSA=82.22+ 0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,用该方程获得预测值与实际值拟合度高。优化的提取条件条件为:提取时间 120.4 min,液料比 15.7 mL/g,乙醇体积分数61.3%,在此条件下,发酵提取物的抗氧化活性可达81.5%。

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Optimizing Extraction Conditions ofAntioxidantion Material inAspergillus sojaeFer mented SesameMeal

Shao Yuanlong Dong Ying
(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013)

Orthogonal design and response surface methodologywere applied to optimize the extraction technolo2 gy of antioxidantmaterial from sesame meal fer mentated byAspergillus sojae.Results:The effects of the infuencing factors for the antioxdation material extraction rank as ethanol volume fraction>ratio of solution to material>time> extraction times in orthogonal design.The regression quadratic equation of RS M to re-optimization experiment fac2 tors influencing the extraction of antioxidantion materials is:RSA=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2,The optimum extraction conditions are time 6h,ratio of solution to material 15.7 mL/g and ethanol volume fraction 61.3%.TheDPPH radical scavening capacity is 81.5%in the pres2 ent experiment.

sesame meal,Aspergillus sojae,optimization,extraction,antioxidantmaterial

TS201 文献标志码:A 文章编号:1003-0174(2010)06-0062-04

江苏省科技攻关项目(BE2005335)

2009-01-09

邵元龙,男,1977年出生,博士,生物资源的深度开发与利用

董英,女,1954年出生,教授,博士生导师,生物化学