响应面优化营养盐对甜高粱茎杆汁液发酵产乙醇的影响

王 敏王 颉孙剑锋牟建楼

(河北农业大学食品科技学院1,保定 071001)

(河北衡水学院生命科学系2,衡水 053000)

响应面优化营养盐对甜高粱茎杆汁液发酵产乙醇的影响

王 敏1,2王 颉1孙剑锋1牟建楼1

(河北农业大学食品科技学院1,保定 071001)

(河北衡水学院生命科学系2,衡水 053000)

燃料乙醇作为石油替代产品之一,可缓解能源供应的压力。以甜高粱秸秆为原料,研究营养盐对发酵生产乙醇产量的影响。在单因素试验基础上,利用 Box-Behnken中心组合设计响应面法对甜高粱茎秆汁液发酵添加营养盐(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2对发酵生产乙醇的影响进行了研究。结果表明,在甜高粱茎秆汁液发酵过程中,通过响应面分析建立添加营养盐与发酵液酒精度之间的回归模型 Y=9.92-0.13X1+0.32 X2-0.23 X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66 X22-0.77 X32-0.76 X42可用于生产预测,最适宜添加量 (NH4)2SO4为 4.61 g/L,MgSO4为 1.64 g/L,KH2PO4为 2.72 g/L,CaCl2为2.82 g/L。在此条件下进行验证试验,重复 3次,酒精度为 9.9%。

Box-Behnken 响应面法 甜高粱汁 营养盐

随着石油燃料供应日趋紧张和环保呼声的日益高涨,寻找和发展替代石油的新能源成为当务之急。目前世界各国均在开展生物质能源的研究工作,主要原料为淀粉质原料(如玉米,美国模式)、糖质原料(如甘蔗,巴西模式)[1-2]。此外,农作物秸秆[3]等木质素原料生产燃料乙醇的研究已经取得阶段性进展。

我国国家统计局数据表明,2006年我国石油生产量 18 476.6万吨,进口量 19 453.0万吨[4],因此,利用可再生能源作为石油的替代品变得愈加重要。2000年我国开始启动以玉米陈化粮为原料的燃料乙醇项目,已取得初步成效。但是使用这些原料存在与粮争地、与人争粮的问题。因此,必须寻求一种不与粮争地、不与人争粮、不与牲畜争饲料、不与其他产业争原料的作物。而甜高粱因符合以上条件而成为较有前途的生物质原料之一[5-6]。

甜高粱是一种高生物量和高糖 C4植物,适应性较强,抗逆性好,在比较贫瘠的土地上可达万斤以上,其茎秆含汁量为 60%～80%,汁液的糖锤度为10%～20%,汁液中含有蔗糖、葡萄糖、果糖等糖份。甜高粱茎秆汁液接种酵母发酵成乙醇,再经精馏即可按一定比例混合到汽油中作为汽车燃料,无论是从经济性还是从解决能源、粮食安全的角度看,都具有广阔的发展前景。因此利用甜高粱液态发酵生产乙醇已成为生物质能源领域中的重要研究课题之一。目前对甜高粱茎秆汁液液态发酵工艺研究报道较多[7-8],而在发酵过程中添加营养盐的研究较少,例如张恩铭等[9]在甜高粱茎秆汁液发酵过程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2,利用正交试验确定最适添加量;刘荣厚等[10]应用正交试验确定了在甜高粱茎秆汁液发酵过程中添加 (NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4的浓度;康利平等[11]确定在发酵过程中添加尿素、MgSO4、CaCl2等可以提高乙醇产率,而利用响应面法优化营养盐对甜高粱茎秆汁液发酵生成乙醇产率影响的内容未见报道。

响应面 (response surface methodology,RS M)是一种综合试验设计和数学建模,通过局部试验回归拟合因素与结果间的全局函数关系,从而得出数学模型的方法。同时对影响生物产量的各因素水平及其交互作用进行优化与评价,因此可快速有效地确定多因素系统的最佳条件[12]。近年来 RS M方法日益受到重视,已在食品品质评价[13]、乳酸生产[14]、新药研制与开发[15-17]等领域得到广泛应用。

研究采用响应面对甜高粱液体发酵过程添加营养盐的效果进行考察和评价,确定较优的发酵条件,以备为后续放大试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜高粱:品种四粒美,2008年 10月采于河北农业大学农场;菌种:丹宝利酿酒高活性干酵母,广东丹宝利酵母有限公司;(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2:分析纯,天津市永大化学试剂开发中心。

1.2 仪器

PR101数字折光仪:日本 ATAGO;LRH-250A生化培养箱:广东省医疗器械厂;三辊式榨汁机:利宝达厨具机械厂;酒精比重计:河北红旗仪表有限公司。

1.3 试验设计

响应面法是通过近似构造一个具有明确表达形式的多项式来表达隐式功能函数。响应面法是一套统计方法,用这种方法来寻找考虑了输入变量值的变异或不确定性之后的最佳响应值。在响应曲面的最优点附近,曲面效应是主导项,用二阶模型来逼近响应曲面。

每个不同变量 X1,X2,X3,…,Xk,表示不同的参数,每个参数的低、中、高水平分别为 -1,0,+1,见式(1):

式中:Xi和 xi分别代表实际值和编码值;X0为Xi的中心点,Δx为变化值[18]。

广义响应面模型描述反应变量的变化[19]见式(2):

式中:Y为预测值;β0为回归系数;βi为 xi的线性效应;βii为 Xi的二次效应;βij为 Xi与 Xj间的线性交互效应[20]。

选用四种营养盐,其 Box-Behnken试验参数水平见表 1,结果用统计软件 Design Expert 7.1.3分析,编码试验因素和水平根据前期单因素试验进行设计列于表1。

根据单因素试验结果,采用 Box-Behnken的中心组合设计对影响发酵的四种营养盐 (NH4)2SO4、 MgSO4、KH2PO4、CaCl2进行研究。

因素 符号 编码水平-1 0 +1 (NH4)2SO4X11 5 9 MgSO4X21 1.5 2 KH2PO4X31.5 3 4.5 CaCl2X40 2.5 5

1.4 液态发酵

榨汁:甜高粱秸秆于 2008年 10月收获后去叶,用三辊式榨汁机压榨,将甜高粱汁保存于 -18℃的冰柜中,备用。

菌种活化:取定量丹宝利酿酒高活性干酵母溶于 2%蔗糖水中,38℃条件下活化 30 min,然后在34℃活化 1 h,备用。

取 20 Birx的甜高粱汁 200 mL加入到 500 mL的三角瓶中,按 5%接种量接入三角瓶,添加不同的营养盐,置于(30±2)℃发酵 3 d后测定酒精度。

1.5 酒精度的测定

取 100 mL发酵成熟醪液于 500 mL蒸馏瓶中,加 50 mL蒸馏水混合均匀进行蒸馏,用 100 mL容量瓶收集馏出液至 100 mL,酒精含量用酒精比重计法测定,并校正至 20℃时的酒精度[21]。

2 结果与分析

2.1 回归模型的确定

Box-Behnken中心组合试验结果见表 2。回归方程各项回归系数显著性检验见表 3。

以 (NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2为自变量,发酵液酒精度为因变量 Y,建立甜高粱茎秆汁液添加营养盐发酵回归模型。由表 3可知,X1、X2、X3、X4的线性项,X1、X2、X3、X4的平方项,X1与 X2,X1与 X3的交互作用对甜高粱茎秆汁液发酵的作用是非常显著的。

利用Design Expert 7.1.3回归拟合试验数据,初步得到回归方程为:

由表 3可知,X1、X2、X3、X4及其平方项、X1X2、X1X3回归系数置信度均在 95%以上,关系显著,其他不显著,所以回归方程优化精简为:

表 2 Box-Behnken设计与试验结果

表3 回归方程各项回归系数显著性检验

表4 回归模型方差分析

由表 4可知,回归方程方差分析显著性检验表明,该模型失拟不显著,回归显著,模型极显著 (P< 0.000 1)。预测值与实测值之间具有高度的相关性系数R2adj=0.966 2,说明模型能解释 96.62%的响应值变化。调整相关系数 R2adj=0.932 5,仅有 6.75%的变异不能由该模型解释,因此回归方程的拟合程度很好,预测值和实测值之间具有高度的相关性,可以用于甜高粱汁液态发酵添加营养盐生产燃料乙醇的理论预测。

2.2 发酵优化工艺参数的验证

图形能够提供一种形象的观测响应值和试验参数水平关系的直观方法。为了观察在其他因素条件固定不变的情况下,某两因素对发酵的影响,通过上面多元回归方程做 X1与 X2,X1与 X3的响应曲面及其等高线图,结果见图 1～图 2。

图 1 响应曲面(X1,X2)和等高线图

图 2 响应曲面(X1,X3)和等高线图

图 1表示(NH4)2SO4、MgSO4的交互作用对酒精度的影响。由图 1可知,二者交互作用显著。这是因为等高线的形状可以反映交互效应的强弱。圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形表示两因素交互作用显著。在 (NH4)2SO4质量分数较低时,随着MgSO4增大得到的酒精度曲面较陡,这说明较低的(NH4)2SO4质量分数对的MgSO4增加较敏感,但是随着MgSO4的质量分数不断增加,发酵液酒精度变化呈先增大后减小的趋势。

图 2表示 (NH4)2SO4和 KH2PO4对发酵产物的影响。在 MgSO4和 CaCl2中心点时,(NH4)2SO4和KH2PO4交互作用显著。随着(NH4)2SO4和 KH2PO4添加量的增加,发酵液酒精度先增加后下降。

为了求得最佳发酵工艺条件,对所得的回归拟合方程分别对各自的变量求一阶偏导数,并令其为0,得到三元一次方程组,求解此方程组可以得出模型的极值点:X1=-0.098 6,X2=0.279,X3= -0.184,X4=0.127,即 (NH4)2SO4=4.61 g/L, MgSO4=1.64 g/L,KH2PO4=2.72 g/L,CaCl2=2.82 g/L,理论预测酒精度 Y=9.99%。在此条件下进行验证试验,重复 3次,酒精度为 9.9%。

3 讨论

营养盐可为酵母提供营养,促进增殖,改善酵母细胞的生长环境。张恩铭等[9]以总糖质量浓度为178.5 mg/mL的高粱汁液发酵,经正交试验确定(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2的添加量为为 1、10、5、5 g/L;康利平等[11]采用总糖为 18.03%的甜高粱汁液发酵,经正交实验的最佳营养盐添加量为3 g/L尿素,2.5 g/L MgSO4·7H2O,CaCl2·2 H2O 5 g/L,酒精度为 8.35%;王锋等[22]采用总糖质量分数为 21.7%的甜高粱汁液发酵,同时在发酵过程中添加了 (NH4)2SO4,KH2PO4,MgSO4,经正交试验验证MgSO4对发酵无益,添加 2 g/L(NH4)2SO4, 5 g/L KH2PO4可得酒精 94.5 g/L。从文献报道中可知,对于营养盐的添加种类及数量不尽相同,除了初始含糖差异,还可能与甜高粱品种及产地造成的茎秆汁液成分差异、以及酵母菌种有关。

4 结论

通过响应面分析建立的甜高粱汁发酵过程中添加(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2与酒精度之间的回归模型高度显著,可用于生产预测。回归方程:Y= 9.82-0.12X1+0.32X2-0.23X3+0.18X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.65X12-0.61X22-0.72X32-0.71X42。添加量分别是 (NH4)2SO4为 4.61 g/L、MgSO4为1.64 g/L、KH2PO4为 2.72 g/L、CaCl2为2.82 g/L,于甜高粱汁液态发酵,酒精度为 9.9%。由此可知,在甜高粱茎杆汁液液态发酵过程中添加营养盐有利于乙醇的生成。

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Opti mization ofNutrition SaltDoses for Ethanol Fer mentation of Sweet Sorghum Juice with Response SurfaceMethodology

WangMin1,2Wang Jie1Sun Jianfeng1Mou Jianlou1
(College of Food Science and Technology,AgriculturalUniversity of Hebei1,Baoding 071001)
(Department ofLife Science,HengshuiUniversity2,Hengshui 053000)

As one of petroleum substitutes,fuel ethanol will relieve the world energy stress.Using sweet sorghum straw as raw material of ethanol fermentation.the influence of adding nutrition salts on the fermentation was studied. Based on single factor experiments,Box-Behnken central composite design of response surface methodologywas ap2 plied to optimize the addition of nutrition salts including(NH4)2SO4,MgSO4,KH2PO4,and CaCl2for the ethanol fer2 mentation process of sweet sorghum juice.Results:The applicability of the model equation Y=9.92-0.13X1+ 0.32X2-0.23X3+0.18 X4-0.20X1X2-0.35X1X3-0.70X12-0.66X22-0.77X32-0.76X42for predicting the optimum response values is verified effectively by experi mental data.The obtained optimum adding dosesof these salts are(NH4)2SO44.61 g/L,MgSO41.64 g/L,KH2PO42.72 g/L,and CaCl22.82g/L.The validate test shows the prod2 uct alcohol content is 9.9%.

Box-Behnken,response surface methodology,s weet sorghum juice,nutrition salts

TK6 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)03-0107-06

保定市科技局生物质能源加工关键技术研究(07N12)

2009-04-05

王敏,女,1977年出生,讲师,博士,食品加工与安全

王颉,男,1959年出生,教授,博士生导师,食品科学