补体C3a对人中巨噬细胞凋亡影响的实验研究*

赵海军，张万江，吴 芳，王 萍，吴江东，李春柱，孟宪杰

[（1石河子大学医学院第一附属医院检验科；2石河子大学医学院病理生理学教研室/（新疆地方与民族高发病）教育部重点实验室，新疆 石河子 832002]

多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是危重病救治中最重要的临床问题和主要死亡原因。急性肺损伤（acute pulmomary damage，APD）在MODS中出现早、发生率高，临床上表现为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。巨噬细胞是参与APD、ARDS与MODS的主要效应细胞，APD、ARDS与MODS发生的原因之一就是巨噬细胞凋亡延迟[2-5]。在APD发生的炎症级联反应过程中，一方面，通过巨噬细胞的激活、脱颗粒和呼吸爆发，导致了组织细胞的炎症损伤，进而导致APD、ARDS与MODS的发生；另一方面，巨噬细胞凋亡的延迟也参与了APD、ARDS与MODS的发生和发展[2～5]。补体C3a 作为重要的前炎性介质，起炎症启动和放大作用；补体C3a参与了包括APD、ARDS与MODS等在内的许多炎性疾病的进程。有研究显示[6～8]，补体C3a既可促使巨噬细胞脱颗粒和呼吸爆发，还能协同其它介质进一步活化白细胞；同时，补体C3a还可通过影响巨噬细胞凋亡而参与APD、ARDS与MODS的发生和发展；为此，本实验通过探讨研究补体C3a对巨噬细胞凋亡的影响，为APD、ARDS与MODS救治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 流式细胞仪（BECKMAN-COULTER XL4美国），CO2恒温孵箱（RKJ，日本），超净工作台（中国上海），台式高速离心机（Sigma），倒置显微镜（Nikon，日本）

1.1.2 主要试剂 rhC3a和Histopaque 1077/1119（Sigma），Annevix-V FITC and PI 凋亡试剂盒（Beckman Coulter），RPMI-1640 培养基（含 100 U/mL青霉素，100U/mL链霉素，10%的胎牛血清，20 mmol/L的L-谷氨酰胺）胎牛血清（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 人巨噬细胞培养与制备 THP-1细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。细胞生长培养基采用含10%FBS的RPMI-1640培养基，每周换液2次。取对数生长期的细胞用于试验，台盼兰染色做活细胞测定，活细胞比率大于95%。试验前离心细胞，重悬于含10%FBS的RPMI-1640培养液，调整细胞浓度为1×106/mL。加入PMA使其终浓度为60 ng/mL，48 h后细胞分化贴壁，更换新鲜培养液。

光镜下见分化前THP-1单核细胞呈球形，悬浮生长并呈无限制繁殖。加入佛波脂（PMA）72 h后，见细胞全部贴壁生长，呈不规则形状，体积明显增大，伸出伪足，提示巨噬细胞形成。

1.2.2 实验分组 计数巨噬细胞数量，调整巨噬细胞浓度为1×106/mL，在含不同刺激剂的RPMI-1640培养基中，37℃、5%二氧化碳的条件下培养，分组实验。实验分4组：补体C3a浓度为0.5μg/mL的巨噬细胞刺激组、补体C3a浓度为1μg/mL的巨噬细胞刺激组、补体C3a浓度为2μg/mL的巨噬细胞刺激组和空白对照组。

1.2.3 巨噬细胞凋亡的定量检测 用4℃的PBS洗涤待测的巨噬细胞2次，用100μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节细胞浓度为 1×106/mL，取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V/FITC和5μL 20μg/mL的PI液，摇匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加入400μL结合缓冲液，1 h、7 h、24 h分别上流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡指数，1 000个/s，总共检测10 000个。

1.2.3 统计分析 结果采用SPSS 13.0统计软件进行双因素析因分析、单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人巨噬细胞培养与制备

人THP-1细胞培养，悬浮生长，呈圆形（图1，2）。

图1 人THP-1细胞培养照片（10×10）

图2 人THP-1细胞培养照片（10×40）

人THP-1细胞经PMA诱导后培养照片，贴壁生长，呈梭形（图 3，4）。

图3 人THP-1细胞加入PMA 48 h后培养照片（10×40）

图4 人THP-1细胞加入PMA 48 h后培养照片（10×40）

2.2 补体C3a依浓度对人巨噬细胞凋亡的影响

以补体C3a浓度为0.5、1和2μg/mL的人巨噬细胞刺激组，其对人巨噬细胞的凋亡率分别为（37.90±2.09）%、（34.52±2.27）%和（32.47±1.65）%；与凋亡率为（57.13±2.89）%的空白对照组相比，均有明显的差异（P＜0.01）；依补体C3a浓度人巨噬细胞凋亡率呈下降趋势，0.5μg/mL与2μg/mL组对比有差异（P=0.04＜0.05）；详见图 5所示。

图5 不同浓度补体C3a刺激人巨噬细胞7 h后其凋亡率的变化（n=3）

2.3 补体C3a刺激依时间对人巨噬细胞凋亡的影响

图6显示：空白组7 h凋亡率为（59.63±2.46）%，24 h后升至（72.15±3.57）%，两者对照有显著差异；补体 C3a组7h凋亡率（34.81±2.28）%，24 h后升至（42.17±3.82）%，两者对照有差异。图6显示，补体C3a组与空白组比较，7 h至24 h凋亡率增加的幅度变小，且有统计学差异。

图6 补体C3a刺激人巨噬细胞随时间其凋亡率的变化（n=3）

3 讨论

巨噬细胞是参与APD、ARDS与MODS的主要效应细胞，APD、ARDS与MODS发生的原因之一就是巨噬细胞凋亡延迟[2～5]。巨噬细胞的凋亡控制着炎症反应的时间和强度，巨噬细胞凋亡的调节是炎症的进展和消退的关键因素，而凋亡紊乱与包括APD、ARDS与MODS在内的多种急慢性炎症性疾病相关[9，10]。研究证实，APD、ARDS与 MODS发病时渗出至肺组织的巨噬细胞存在凋亡延迟[3]；PARSEY[11]通过动物实验研究证实，在炎症早期巨噬细胞凋亡是受抑制的。SOOHAI[4]发现，随着巨噬细胞凋亡的增强，缺血/再灌注损伤导致的肺损伤程度明显减轻。TAKESHI[5]研究发现，使用连续性肾脏替代治疗技术，可通过清除患者血清炎症因子（IL-1，IL-8，TNF-α）明显改善巨噬细胞的凋亡延迟，且与组织器官损伤评分相关的。

补体C3a是补体系统级链反应的终末产物，由86个氨基酸组成，补体C3a通过其受体补体C3aR而产生生物学效应。C3a为重要的前炎性介质，起炎症启动和放大作用，补体C3a参与了包括MODS、ARDS与APD等在内的许多炎性疾病进程[6～8]。补体C3a趋化巨噬细胞，也可直接或间接活化巨噬细胞释放弹性蛋白酶、活性氧和炎症因子等而损伤肺组织[12]，创伤后发生APD、ARDS与MODS的患者血浆和支气管灌洗液中补体C3a浓度显著增高，且其升高的水平与患者的创伤评分呈正相关[13]。

本实验结果显示，补体C3a能明显抑制人巨噬细胞凋亡，且随浓度增加抑制作用有增强的趋势，与既往的实验结果相一致；本实验不论对照组和刺激组的凋亡率和已有实验相比均明显升高，这与以往较多实验是使用PI染色主要观察晚期凋亡，而本实验使用Annevix-PI双染色法，可同时检测早中晚期凋亡有关。此外，应用不同浓度的补体C3a刺激，其凋亡率无显著差异。一方面，提示补体C3a浓度为0.5μg/mL，刺激已达饱和浓度，另一方面，也可能是刺激时间短，抑制作用体现不足。此外，样本数少也可能使差异未显现。

本实验还显示：巨噬细胞凋亡随时间而增加，7 h凋亡率为（59.63±2.46）%，24 h时即升至（72.15±3.57）%，两者对照有显著差异；但24 h的巨噬细胞凋亡增加幅度明显为低。补体C3a刺激7 h组凋亡率（34.81±2.28）%，随着补体C3a刺激时间的延长，其抑制巨噬细胞凋亡的作用持续存在，24 h后升至（42.17±3.82）%；与补体C3a刺激7 h相比，24 h的巨噬细胞凋亡显著增加，但幅度也明显为低。这与本实验的空白对照组和已有实验结果趋势相一致。上述结果显示了补体C3a刺激后巨噬细胞凋亡存在时间依赖关系。

综上所述，本研究显示补体C3a抑制巨噬细胞凋亡存在浓度及时间依赖关系；补体C3a延长巨噬细胞的炎性反应的时间，可能由此导致炎症失控和消散延迟，从而参与了APD、ARDS与MODS的发生发展。

[1]韩守信，陈复辉，周 丹,等.急性肺损伤中性粒细胞凋亡异常及早基强的松龙调控的研究 [J].中国现代医学杂志,2007,17(2):167-171.

[1]HAN SX,CHEN FH,ZHOU D,et al.Abnormality of PMA apoptosis and effect of methylpredhisolone in acute lung iniury induced by administrating oleic acid[J].China journal of modern meoicine,2007,17(2):167-171.Chinese

[2]BERNARD GR,ARTIGAS A,BRIGHAM KL,et al.Report of the American-European consensus conference on ARDS:definitions, mechanisms,relevant outcomes, and clinical trial coordination.Intensive Care Med,2006;20:225-236.

[3]GOANNOUDIS PV.Current concepts of the inflammatory response after major trauma:an update[J].Injury,2008,34(6):397-404.

[4]SOOKHAI S,WANG JJ,MC COURT M,et al.A novel therapeutic strategy for attenuating neutrophil-mediated lung injury in vivo[J].Ann Surg,2009,235(2):285-291.

[5]HIRANO T,HIRASAWA H,ODA S,et al.Modulation of polymorphonuclear leukocyte apoptosis in the critically ill by removal of cytokines with continuous hemodiafiltration [J].Blood Purif,2007,22(2):188-197.

[6]HUBER-LANG MS,YOUNKIN EM,SARMA JV.et al.Complement-induced impairment of innate immunity during sepsis[J].J Immunol 2006;169(6):3223-3231.

[7]NIEDERBICHLER AD,HOESEL LM,WESTFALL MV,et al.An essential role for complement C3a in the pathogenesis of septic cardiac dysfuntion.The Journal of Experimental Medicine 2006;203(1):53-61.

[8]PETER A.Ward.The dark side of C3a in sepsis[J].Nature immunology.2007,4:133-142.

[9]JIMENEZ MF,WATSON WG,PARODO J,et al:dysregulated expression of neutrophil apoptosis in the systemic inflammatory response syndrome[J].Arch Surg,2007,132:1263-1270.

[10]DROEMANN D,ARIES SP,HANSEN F,et al.decreased apoptosis and increased activation of alveolar neutrophils in bacterial pneumonia[J].Chest,2006,117:1679-1684.

[11]PARSEY MV,KANEKO D,SHENKAR R,et al.Neutrophil apoptosis in the lung after hemorrhage or endotoxemia:apoptosis and migration are independent of IL-1belta[J].Clin Immunol,2008,91(2):219-225.

[12]SHOWELL HJ,GLOVSKV MM.WARD PA.C3a-induced lysosomal enzyme secretion from human macrophages[J].Int arch allergy immunol.2007;67:227.

[13]FOSSE E,PILLGRAM-LARSEN,SVENNEVIG JL,et al.Complement activation in injured patients occurs immediately and is dependent on the severity of the trauma[J].Injury.2008,29(7):509-514.