玻璃体腔联合用药治疗实验性外伤性玻璃体出血*

招志毅，彭燕一

（桂林医学院附属医院 眼科，广西 桂林 541001）

眼外伤常常引起玻璃体腔内出血，导致增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）。伴玻璃体出血的眼球穿通伤PVR发生率远远高于视网膜脱离手术后PVR发生率[1]。目前，治疗玻璃体出血的药物并不理想。蛇毒降纤酶是从尖吻蝮蛇毒液中分离、纯化的凝血酶样酶制剂。药理上它能降低血浆中纤维蛋白原含量，以及激发血管内皮细胞释放组织型溶纤酶原激活物，激活纤溶酶原，水解纤维蛋白，促进出血的吸收[2]。曲安奈德是一种长效糖皮质激素，能够减轻炎症反应，抑制细胞的增生，有减轻PVR形成的作用[3，4]。本实验观察了蛇毒降纤酶联合曲安奈德在外伤性玻璃体出血的治疗效果，并对其玻璃体腔细胞因子的变化进行了检测。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康新西兰大白兔40只，体重2.25～2.5 kg，雌雄各半，右眼为实验眼，左眼为空白对照眼。右眼随机分为生理盐水组（10眼）、蛇毒降纤酶组（10眼）、曲安奈德组（10眼）、联合用药组（10眼）。

1.1.2 主要试剂和仪器 蛇毒降纤酶5u/瓶（广西医科大学蛇毒研究所提供），曲安奈德40mg/（mL·瓶）（昆明积大制药有限公司），MMP-9、TGF-β1酶联免疫吸附测定试剂盒由美国Bionewtrans Pharmaciutical公司提供。Clinibio128酶标检测仪，电子显微镜（日本HITACHI H-600型）。

1.2 动物模型制作

术前3 d点用洛美沙星眼液，复方托品酰胺散瞳，肌肉内注射氯胺酮35mg/kg+氯丙嗪5mg/kg，分离上方9～3点的球结膜，在角膜缘后2mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，勿伤及晶状体及周边视网膜，用剪刀向两侧扩大切口，切口与角膜缘平行，达8mm，轻压眼球，将脱出的玻璃体剪除，用8-0尼龙线间断缝合切口。以2mL注射器抽取兔耳动脉血1mL，玻璃体腔注入0.3mL全血。用1mL注射器按实验各组要求把药物注入玻璃体：生理盐水组注射生理盐水0.1mL；蛇毒降纤酶组注射蛇毒降纤酶0.1 u/0.1mL；曲安奈德组注射曲安奈德1.0mg/0.1mL；联合用药组分别注射曲安奈德1.0mg/0.1mL及蛇毒降纤酶0.1 u/0.1mL。

1.3 实验方法

1.3.1 玻璃体出血指数观察 采用文献报道[5]分级方法。根据眼底4个象限可见程度分0～3级，各象限级别相加，总和即为指数。0级：积血完全吸收，眼底清晰。1级：玻璃体轻度积血，眼底轻度模糊，但尚能看清。2级：玻璃体中度积血，眼底很难看清，仅可见模糊结构。3级：玻璃体重度积血，眼底窥不进。手术后每2天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录玻璃体出血指数。

1.3.2 PVR分级观察 采用Fastenberg分级方法[6]。手术后每2天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录PVR程度。

1.3.3 玻璃体液MMP-9、TGF-β1浓度检测 手术后7、14 d实验眼抽取0.1mL玻璃体液，ELISA检测MMP-9、TGF-β1光密度值。具体操作见试剂盒说明书。计算MMP-9、TGF-β1浓度。

1.4 视网膜毒性评价

手术后28 d取离视盘下方2mm处视网膜行常规HE染色、醋酸双氧铀与枸橼酸铅双重染色后行光学和电子显微镜检查。

1.5 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理。数据以均数标准差（±s）表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。数据分析采用t-test、ANOVA及非参数检验Mann-Whitney Test法。

2 结果

2.1 玻璃体出血指数观察

手术后3 d联合用药组、蛇毒降纤酶组的眼底逐渐清晰，玻璃体尘状混浊，基本能看到视网膜情况；生理盐水组、曲安奈德组仍见玻璃体棕色混浊，眼底窥不清。见表1。

表1 手术后3 d玻璃体出血指数（±s）

表1 手术后3 d玻璃体出血指数（±s）

注：†表示与生理盐水组比较

组别 眼数 指数 P（Mann-Whitney Test）生理盐水组 10 9.5±0.6 -蛇毒降纤酶组 10 6.5±0.7 P＜0.01†曲安奈德组 10 9.0±0.8P＞0.05†联合用药组 10 6.8±0.4P＜0.01†

2.2 PVR分级观察

手术后28d联合用药组PVR程度低于生理盐水组，两组 PVR 程度比较：P=0.0013＜0.01（Mann-Whitney test）。联合用药组PVR程度与蛇毒降纤酶组、曲安奈德组未见统计学意义，分别为P=0.4359＞0.05；P=0.3742＞0.05；（Mann-Whitney test）。见表2。

表2 手术后28 d PVR分级（例数）

术后28 d联合用药组4眼（40%）发生视网膜脱离，比生理盐水组（100%）、蛇毒降纤酶组（50%）及曲安奈德组（60%）低。

2.3 玻璃体腔中MMP-9检测

手术后7d、14d联合用药组玻璃体液MMP-9浓度比生理盐水组低（分别为t值：3.512、P值=0.0025＜0.01；t值：6.7545、P值=0.0005＜0.01；t-test）；与曲安奈德组、蛇毒降纤酶组相比未见统计学意义（分别为7d t值：2.0068、P值=0.06＞0.05；t值：0.1574、P值=0.8767＞0.05；14 d t值：1.4024、P ＞0.05；t值：1.299、P值=0.2351＞0.05；t-test）。见表3。

表3 玻璃体液MMP-9浓度的比较（pg/mL，±s）

表3 玻璃体液MMP-9浓度的比较（pg/mL，±s）

注：1）各组间玻璃体液 MMP-9 含量比较，P=0.024＜0.05；2）P=0.017＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

组别生理盐水组蛇毒降纤酶组曲安奈德组联合用药组7d1） 14d2）343.75±57.19 384.64±33.22 231.56±39.48 283.39±44.44 321.52±109.71 313.57±85.56 235.93±78.45 251.79±21.07

2.4 玻璃体腔中TGF-β1检测

手术后7 d、14 d联合用药组玻璃体液TGF-β1浓度比生理盐水组低（分别为t值：2.8445、P值=0.0108＜0.05；t值：3.2426、P值=0.0176＜0.05；t-test；）。与蛇毒降纤酶组、曲安奈德组相比未见统计学意义（分别为7d t值：0.3315、P值=0.7441＞0.05；t值：0.4282、P值=0.6736＞0.05；14 d t值：1.3245、P值=0.2269＞0.05；t值：1.052、P值=0.087＞0.05；t-test）。见表4。

表4 玻璃体液TGF-β1浓度的比较（pg/mL，±s）

表4 玻璃体液TGF-β1浓度的比较（pg/mL，±s）

注：1）各组间玻璃体液 TGF-β1 含量比较，P=0.036＜0.05；2）P=0.025＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

组别生理盐水组蛇毒降纤酶组曲安奈德组联合用药组7d1） 14d2）102±35.47 123.18±34.34 65.58±25.52 80.65±21.04 56.67±24.47 51.41±13.13 61.65±27.46 65.53±9.23

2.5 视网膜毒性评价

视网膜光镜检查见联合用药组视网膜各层结构整齐；电镜检查视网膜内外节排列整齐。

3 讨论

本实验尝试玻璃体腔联合应用促进出血吸收的药物蛇毒降纤酶和抗炎药物曲安奈德治疗实验性外伤性玻璃体出血，观察其对治疗玻璃体出血及防治PVR的效果。蛇毒降纤酶是从蛇毒提取经生物技术纯化精制的一种强效凝血酶样酶，可直接作用于血浆纤维蛋白原的肽链A，形成脱肽链A纤维蛋白可溶性单体而被溶纤酶迅速消溶；另外，蛇毒降纤酶还能激发血管内皮细胞产生组织溶纤酶原激活物促进出血的吸收[2]。曲安奈德是一种长效糖皮质激素，具有很强的抗炎作用，可降低炎症血管的渗透性、减少血-视网膜屏障的破坏。有学者报道，玻璃体腔应用曲安奈德可以减轻PVR形成的程度[3，4]。在本实验中，联合用药组玻璃体出血指数、PVR程度明显比生理盐水组低，说明蛇毒降纤酶和曲安奈德能明显促进玻璃体腔出血的吸收，以及降低PVR的发展程度。通过实验各组视网膜脱离率的比较，我们发现玻璃体腔联合用药组较单一用药更能降低视网膜脱离率的发生。

在本实验中，我们发现联合用药组玻璃体液MMP-9、TGF-β1浓度比生理盐水组低。目前认为，细胞因子对增殖细胞迁移、增生的调控起着重要的作用。MMP-9是一种含有锌指结构的中性蛋白酶，可由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞及巨噬细胞分泌，具有降解变性胶原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型天然胶原的活性，并参与了炎症反应和伤口愈合过程[7，8]。有学者认为，其与纤维增生性PVR形成有关[9～11]。TGF-β1是一种多功能、高度双向的细胞调节因子，能促进单核细胞、成纤维细胞迁移和增殖却抑制上皮细胞、内皮细胞的分裂和增殖，血小板是其最主要的来源，但玻璃体腔中RPE细胞及巨噬细胞也能分泌并释放TGF-β1。有文献报道，TGF-β1始终参与 PVR 的发生及发展[12，13]。联合用药组通过曲安奈德抗炎作用，使向玻璃体腔迁移的RPE细胞、巨噬细胞及血小板较生理盐水组减少；通过蛇毒降纤酶促进出血吸收的作用，减轻了玻璃体出血引起的、以巨噬细胞为主的慢性玻璃体炎症。因此，我们推测这可能是联合用药组玻璃体腔的MMP-9、TGF-β1浓度较生理盐水低的原因。相反，玻璃体腔MMP-9、TGF-β1浓度的降低反过来又抑制增殖细胞迁移、增生以及细胞外基质的形成。我们推想，这可能是联合用药组PVR程度低于生理盐水组、视网膜脱离率低于各组的原因。

在本实验中，联合用药组玻璃体液MMP-9、TGF-β1浓度与蛇毒降纤酶组、曲安奈德组相比未见统计学意义，这是否是联合用药组PVR程度与曲安奈德组、蛇毒降纤酶组相比下降不明显的原因之一，还待进一步研究。最后，通过视网膜光镜、电镜检查，未见联合用药对视网膜有毒性作用。

综上所述，玻璃体腔曲安奈德和蛇毒降纤酶联合应用可以促进玻璃体腔出血的吸收、降低外伤性PVR程度；同时，下调玻璃体腔MMP-9、TGF-β1浓度。与单独应用曲安奈德、蛇毒降纤酶相比，玻璃体腔联合用药更能降低视网膜脱离率的发生，但PVR下降程度与单一药物组相比未见统计学意义。

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