甘精胰岛素对糖尿病大鼠主动脉结构及TGF-β1、III型胶原表达的影响

金秀平，谷 巍

（华北煤炭医学院附属医院 内分泌科，河北 唐山 063000）

糖尿病引起动脉粥样硬化（atherosclerosis AS）发病早、发病率高、病情进展快，是糖尿病主要死亡原因。本研究旨在观察甘精胰岛素对糖尿病大鼠主动脉结构及TGF-β1、III型胶原表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性Wistar大鼠50只，体重180～220克（华北煤炭医学院动物中心），STZ（美国sigma公司），甘精胰岛素（长秀霖），Masson特染试剂盒（福州迈新生物技术公司），免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 50只大鼠随机分对照组10只、实验组40只。实验组造模前禁食12 h，按65 mg/kg腹腔注射STZ，对照组注射相应体积0.1mol/L无菌柠檬酸缓冲液。注射后分别于3 d、1周同一时间剪尾测血糖，血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠模型成立。造模过程中2只死亡。将造模成功38只随机分糖尿病组19只、胰岛素组19只。糖尿病组不给任何治疗，常规喂养。胰岛素组给予甘精胰岛素1.5 U/kg/d，根据血糖监测调整胰岛素剂量，维持血糖在8mmol/L左右。

1.2.3 生化指标的检测 各组分别于造模前，造模后1周、治疗后1、2、4周测体重，剪尾测血糖。治疗后4周日立全自动生化分析仪酶法测血清TG、TC、LDL-C、HDL-C。

1.2.4 免疫组化测定 采用免疫组化试剂盒，SABC法，免疫组化图象分析经标准灰度校正，随机取5个视野，同等条件下测TGF-β1及III型胶原平均积分光密度值IDP。

2 结果

2.1 大鼠体重及各项实验室指标改变

造模前各组体重、血糖、血脂无明显差异（P＞0.05）。造模后1周比对照组血糖明显升高（P＜0.01），体重明显下降（P＜0.01），治疗后1周胰岛素组比糖尿病组，血糖明显下降（P＜0.01），体重明显升高（P＜0.01），治疗后4周糖尿病组比对照组血脂明显增高（P＜0.05），胰岛素组比糖尿病组血脂明显下降（P＜0.05）。结果见表1-3。

表1 各组大鼠不同时期体重变化比较（g，±s）

表1 各组大鼠不同时期体重变化比较（g，±s）

注：1）与对照组相比，P＜0.01；2）与模型组相比，P ＜0.01；3）同组相比，P ＜0.05

体重 对照组 模型组 胰岛素组造模前 202.54±13.42 204.41±9.80 205.91±10.67治疗前 258.36±17.56 182.14±12.201） 193.33±22.961）治疗后1周 288.60±27.92 199.46±7.821） 231.61±24.911，2）治疗后2周 335.72±27.83 211.00±8.841） 257.71±22.801，2）治疗后 4周 376.00±25.233） 210.23±11.421） 304.00±25.413）

表2 各组大鼠不同时期血糖情况变化比较（±s，mmol/L）

表2 各组大鼠不同时期血糖情况变化比较（±s，mmol/L）

注：1）与对照组相比，P＜0.01；2）与模型组相比，P ＜0.01

血糖 对照组 模型组 胰岛素组造模前 6.62±0.47 6.61±0.76 6.62±0.67治疗前 6.18±0.47 28.27±4.191） 30.91±1.951）治疗后 1周 6.51±1.22 31.07±2.981） 16.15±7.801，2）治疗后2周 6.56±0.77 32.04±1.541） 10.34±7.252）治疗后4周 6.32±0.80 32.18±1.331） 6.91±3.582）

表3 各组大鼠血脂情况比较（±s，mmol/L）

表3 各组大鼠血脂情况比较（±s，mmol/L）

注：1）与对照组比，P ＜0.05；2）与糖尿病组比，P ＜0.05

组别 数量 TC TG HDLC LDLC对照组 10 0.43±0.05 0.22±0.05 0.44±0.01 0.08±0.03糖尿病组 19 1.73±0.541） 1.21±0.381） 0.22±0.061） 0.49±0.131）胰岛素组 19 0.45±0.042） 0.50±0.152） 0.43±0.092） 0.06±0.032）

2.2 主动脉光镜观察

HE染色见图1，Masson染色见图2。

对照组：内膜平坦，内皮细胞扁平，中层平滑肌细胞整齐排列，平滑肌细胞间有少量胶原纤维。糖尿病组：内膜增厚，局部有内皮细胞脱落，中层平滑肌排列紊乱，可见少量体积大、胞浆空的泡沫细胞，胶原纤维增多。胰岛素组：内膜较厚，内皮细胞脱落较少，中层平滑肌细胞平行排列，胶原增多不明显。采用计算机图像分析系统进行半定量分析测内膜厚度及中膜厚度（表4）：糖尿病组比对照组内膜厚度及内膜/中膜厚度明显升高（P＜0.05），胰岛素组比糖尿病组明显降低（P＜0.05）。同时，比较各组胶原面积占统计总面积百分比（表5）：糖尿病组比对照组胶原面积明显升高（P＜0.05），胰岛素组比糖尿病组明显降低（P＜0.05）。

表4 各组大鼠主动脉内膜厚度及中膜厚度情况比较（±s）

表4 各组大鼠主动脉内膜厚度及中膜厚度情况比较（±s）

注：1）与对照组比，P ＜0.05；2）与糖尿病组比，P ＜0.05

组别 数量 IMT（μm） IMT/IFT（%）对照组 10 4.56±1.01 3.21±1.05糖尿病组 19 21.61±3.611） 15.25±1.061）胰岛素组 19 12.61±1.611，2） 6.84±1.671，2）

表5 各组大鼠主动脉胶原面积占统计总面积百分比（±s）

注：1）与对照组比，P ＜0.05；2）与糖尿病组比，P ＜0.05;

组别 数量 胶原面积/统计血管总面积（%）对照组 10 2.46±1.09糖尿病组 19 38.19±6.561）胰岛素组 19 18.98±5.611，2）

2.3 主动脉透射电镜观察

对照组：内皮细胞扁平，细胞间可见完整紧密连接，内弹性膜完整。糖尿病组：内膜明显增厚，内皮细胞脱落，细胞核分裂，内弹性膜不连贯。胰岛素组：内皮细胞较完整，表面粗糙，细胞间可见细胞连接结构，内弹性膜完整，结果见图3。

2.4 免疫组化结果：TGF-β1及III型胶原的表达

阳性结果（TGF-β1表达在细胞浆和细胞间，III型胶原表达在平滑肌细胞浆和细胞间）显棕黄色，正常大鼠组织切片作为阴性对照。TGF-β1：糖尿病组（0.0987±0.0198）比对照组（0.0179±0.0018）表达明显升高（P＜0.05），胰岛素组（0.0198±0.0019）比糖尿病组表达明显降低（P ＜0.05）；III型胶原：糖尿病组（0.0457±0.0128） 比对照组（0.0138±0.0020）表达明显升高（P＜0.05），胰岛素组（0.0130±0.0029）比糖尿病组表达明显降低（P＜0.05），见图 4、图 5。

图1 主动脉HE染色（×400）

图2 主动脉Masson染色（×400）

图3 主动脉电镜

图4 各组主动脉免疫组化TGF-β1表达情况

图5 各组主动脉免疫组化III型胶原表达情况

3 讨论

AS是糖尿病大血管病变病理基础[1]，动脉平滑肌细胞增生是AS重要组成部分，内膜平滑肌灶性增生是AS最早可识别形态学变化[2]。研究显示，STZ造模4周后，透射电镜观察到糖尿病组大鼠主动脉内皮细胞大面积脱落，中膜浅层平滑肌细胞明显增生活跃并向内膜层迁移，平滑肌周围有大量胶原纤维增生，提示糖尿病主动脉结构发生了病理改变。非酶糖化蛋白终末产物（AGE）导致胶原的绞连，基底膜增厚，并可与特异AGE受体结合，促进某些细胞因子释放，如高血糖与AGE均可刺激TGF-β1合成[3]。TGF-β1是一种多功能细胞因子，主要作用是调节细胞外基质（ECM）形成，使成纤维细胞合成胶原、层粘连蛋白等[4]。研究显示，TGF-β1在糖尿病大鼠主动脉中表达明显增高，血管平滑肌细胞间III型胶原表达也增高，表明高血糖通过TGF-β1促使ECM增生，进而促进中层平滑肌细胞增生并向内膜迁移。

胰岛素能降低血糖，抑制脂肪分解，美国学者研究还发现，胰岛素具有抗炎及抗动脉粥样硬化作用[5]。甘精胰岛素（insulin glargin〔GlyA21，Arg-B31，ArgB32〕）是超长效胰岛素类似物，目前已应用于临床。它是利用重组DNA技术生产的生物合成人胰岛素类似物。本研究中，糖尿病大鼠注射甘精胰岛素后，主动脉病理改变明显减轻，血糖、血脂下降，血管壁TGF-β1及collagen III表达明显降低，提示甘精胰岛素可能通过降低血糖、血脂，下调TGF-β1及collagen III表达，从而抑制主动脉内ECM增生，改善糖尿病大血管病变，但具体作用机制有待进一步研究。

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[2]STOUT RW.Hyperinsulinemia and atherosclerosis.Diabetes,1996 Jul;45 Suppl 3;S45-6

[3]HAO FENG,YU Jinde.High glucose enhance expression of matrix metalloproteinase-2 in smooth muscle cells[J].Acta Pharmacol Sin,2003,24(6):534–538

[4]ZIYADEL FN,SHERMA K,ENICKSEN M.et al.Stimulation of collagen game expression and protein synthesis in murine mesangial cells by acti vation of transforming growth factor- B1 JClinlnvest 1994,93:536.

[5]ROSS R,et al.The responsets injury and atherosclerosis:the rote of endothelium and smooth muscle.Atheroscleresis 1987,8(6):69.