短乳杆菌NCL912耐酸性研究

黄桂东，李超波，曹郁生

1(食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学中德联合研究院，江西南昌，330047)2(河南科技大学食品科学和生物工程学院，河南洛阳，471003)

短乳杆菌NCL912耐酸性研究

黄桂东1，2，李超波1，曹郁生1

1(食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学中德联合研究院，江西南昌，330047)2(河南科技大学食品科学和生物工程学院，河南洛阳，471003)

研究了短乳杆菌NCL912在酸性环境下的生长及在pH2.0极端酸性环境中的耐酸性能。比较了在含L-谷氨酸钠与不含L-谷氨酸钠的培养基中该菌的生长、耐酸性、γ-氨基丁酸产量及谷氨酸脱羧酶活力，并对其耐酸机理进行了分析。结果表明，短乳杆菌NCL912在pH＞3.0的酸性环境中可以生长，在pH5.0的培养基中生长较好，在pH 2.0的培养基中可以存活4～6 h。含L-谷氨酸钠培养基中细菌生长较好，在pH 4.0时，L-谷氨酸钠全部转化为γ-氨基丁酸，产量达11.44g/L;在2种培养基中细菌的存活率存在显著性差异(P＜0.05)，谷氨酸脱羧酶活力也存在显著性差异(P＜0.05)，含L-谷氨酸钠培养基中细菌耐酸性强，酶活力高。由此可见，短乳杆菌NCL912能够耐受低pH的原因可能与γ-氨基丁酸的生成有关，即其耐酸机制可能是谷氨酸-γ-氨基丁酸对向运输机制。

短乳杆菌NCL912，L-谷氨酸钠，γ-氨基丁酸，谷氨酸脱羧酶

乳酸菌具有多种生物活性，具有公认的食品应用安全性(generally regarded as safe，GRAS)，已经成为食品工业中重要的微生物和益生菌来源。而应用于食品或益生菌制剂中的乳酸菌一旦被宿主摄入体内，就必须要耐受宿主胃的极端酸环境和肠道的弱酸环境(pH 4.0～6.0)。有研究表明，单胃动物胃液pH值一般在2.0左右，进食后pH值可达3.0～5.0，饥饿状态下的pH值是1.5，食物在胃中大约需要2 h才能被初步消化进入肠道［1－2］。因而乳酸菌对酸性环境的耐受能力是其能否在胃肠道生长、生存并发挥有益作用的重要考察因素。另外，乳酸菌在糖发酵时产生乳酸，说明乳酸菌在生长过程中也要经常面对酸性环境［3］。

本研究所使用的Lactobacillus brevis NCL912是从泡菜中分离得到的，培养基中若添加足量的底物L-谷氨酸钠(L-glutamate sodium，L-MSG)，那么该菌可以将L-MSG转化为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，GABA产量高达80g/L以上。GABA是谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)生物催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成的，GAD是该反应唯一的酶［4］。在大肠杆菌等原核微生物中，GAD酶途径由于其可以调控环境的pH值而与细菌生长的耐酸机制有关［5－6］。尽管有研究表明，很多乳酸菌可以将谷氨酸转化为GABA，但阐述GABA与乳酸菌酸耐受机制的相关报道较少，尤其是短乳杆菌，还未见耐酸机制的相关研究，目前，仅有的关于Lactococcus lactic的研究表明，GAD与酸耐受性直接相关［7］。

因此，研究短乳杆菌NCL912在酸性条件下的生长及其在极端酸性环境下的耐酸能力，对了解该菌的生理代谢特点，扩大其应用范围具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌Lactobacillus brevis NCL912，本实验室分离保存。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基(1L)

葡萄糖25 g，大豆蛋白胨6.25 g，酵母浸膏6.25 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·4H2O 0.025 g，5mL Tween 80，L-谷氨酸钠终浓度0.1mol/L。

1.2.2 发酵培养基(1L)

葡萄糖50 g，大豆蛋白胨12.5 g，酵母浸膏12.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，10mL Tween 80。作为实验组用培养基。

1.2.3 对照培养基(1L)

葡萄糖50 g，大豆蛋白胨12.5 g，酵母浸膏12.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，10mL Tween 80，L-谷氨酸钠终浓度0.1mol/L。作为对照组用培养基。

1.3 方法

1.3.1 菌体的培养

挑取单菌落接种于种子培养液中，32℃静置培养24 h，然后将其接种于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，32℃，150 r/min摇床培养12h，活化2次。

1.3.2 pH值对菌体生长的影响

取活化2次后的菌液，5 000 r/min离心5 min，然后将离心后的菌体(4.1×109)接种于不同初始pH(自然 pH，5.0，4.0，3.5，3.0)的 100mL 发酵培养基中，接种量为10%，32℃静置培养(后面的培养，若没有特殊说明，接种量和培养温度不变)，每隔2h取样，测OD600nm，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制不同初始pH下菌的生长曲线，并测定培养基pH值、GABA的变化。培养基pH值用盐酸和氢氧化钠调节，pH值的偏差是±0.1。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 L-MSG对菌生长的影响

按1.3.2的方法将菌株接种于对照培养基中，并取样，绘制不同初始pH下菌体生长曲线，并测定培养基pH值、GABA的变化。比较发酵培养基和对照培养基培养的菌体的生长、pH值、GABA的变化。

1.3.4 测定方法

pH的测定:用酸度计测定。

GABA的定性及定量测定:采用薄层层析的方法对GABA进行定性分析，预染纸层析的方法进行GABA的定量测定［8］。具体定量方法如下，所使用的展开剂为 V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=5∶3∶2，展开剂中含有4g/L的茚三酮。在层析纸上的上样量为2μL，然后将上样之后的层析纸放置到装有展开剂的层析缸中展开3 h，取出烘干，剪取GABA的点放置于洗脱剂中，洗脱剂为V(75%的乙醇)∶V(0.6%CuSO4)=38∶2，最后在紫外分光光度计上，512 nm处测定洗脱剂的吸光度值。

1.3.5 耐酸性实验

取活化2次后的稳定期的菌液10mL(4.1×109)，8 000 r/min离心5 min，将菌体接种于pH 2.0的100mL发酵和对照培养基中，32℃静置培养0～6 h，每隔2 h取样。每次吸取0.5mL的菌液加入到4.5mL无菌水中，摇匀即制成了10倍稀释液，依此再稀释不同倍数。取稀释样品100μL于已制备好的含已灭菌琼脂培养基的培养皿中，32℃静置培养48 h，待菌落长出后，统计菌落数。所有实验均重复3次，取平均值。

1.3.6 粗酶提取液的制备

取不同酸性pH培养基培养的菌液，8 000 r/min离心10min，收集的菌体用PBS(pH值7.0)充分洗涤2次，将其重悬于20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.2)中，内含 0.01 mmol/L PLP，1 mmol/L β-巯基乙醇，0.2mg/mL溶菌酶，40℃反应30 min。反应结束后置于冰浴中，超声波进一步破碎。细胞碎片用冷冻离心(8 000 r/min，10 min)除去，得上清液，即为GAD粗酶液。

1.3.7 GAD酶的活性测定

取 200μL 的粗酶液，加 400μL 底物溶液(0.2mol/L Na2HPO4－柠檬酸缓冲液，含10 mmol/L L-MSG，pH 5.0)，37℃反应1 h，90℃灭活5 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液，采用薄层层析和预染纸层析的方法［10］进行GABA的定性和定量分析。在上述测定条件下，每分钟产生1 μmol的GABA所需的酶量定义为1个酶活力国际单位(U)。比较发酵组和对照组在不同酸性pH值条件下菌的GAD酶活力，观察L-MSG对酶活力的影响。

1.3.8 统计学分析

本研究采用SPSS17.0统计软件进行分析。试验结果数据用均数±标准差(x±s)表示，发酵组和对照组之间的差异性及各自组内的差异性采用one way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌的生长曲线及培养液pH值的变化

由图1可以看出，短乳杆菌NCL912的对数生长期是2～20 h。该菌NCL912在pH值＞3.0的酸性环境中可以生长且在初始pH值5.0的培养基中生长较好。

图1 菌体的生长曲线

而培养液的pH值(图2)在培养的初期(0～6h)有所升高，不同培养液pH值变化差值分别为0.38，0.77，0.20，0.30。随着培养时间的延长，培养液的 pH值有所下降，分别为1.75，1.24，0.81和0.44。

图2 发酵培养液pH的变化曲线

2.2 对照培养基培养菌的生长曲线和培养液pH值的变化

由图3可以看出，在对照培养基中菌的生长与发酵培养基中菌的生长趋势一致。在0～8 h，初始pH值5.0的菌体生长最好，8 h后初始pH值4.0的菌生长最好。这是因为培养基pH值发生了变化。随着培养时间的延长，培养液pH值升高(图4)，8h后初始pH值4.0的培养液pH值升高至5.0左右。所以，认为该菌在对照培养基中的最适pH值是5.0左右，和发酵培养基中菌体最适pH值一致。另外，该菌在对照培养基中比在发酵培养基中生长得好。对照培养基培养的稳定期菌液的吸光度(pH值4.0，5.0)是发酵培养基菌液吸光度的1.61和1.33。而在自然pH值时，2种培养基中稳定期菌液的吸光度之间的差别不是很大。

图3 对照组菌体生长曲线

图4 对照组培养液pH的变化

2.3 培养液中GABA的变化

由图5中GABA量的变化可以看出，由于对照培养基中底物L-MSG的加入，该菌可以将其转化为GABA，所以培养液中GABA的产量随着培养时间的延长有所升高。初始pH5.0，4.0，3.5的菌株产GABA的量较高，其产量分别达 10.94，11.44和10.77g/L，L-MSG得到完全的利用。GABA是弱碱性物质，所以GABA的产生使得对照培养液pH值上升，从而保护了菌体，能够耐受低酸环境而生长及生存。

图5 培养液中GABA的变化曲线

由图5还可以看出，发酵组培养的菌株只在培养的初期会产生少量的GABA。这是因为培养基中存在的少量L-谷氨酸或相应的盐被菌株所利用而产生的。在低pH时，发酵培养基中培养的菌株比对照培养基培养的生长差，原因之一就是与GABA的生成有关。因为GABA产生得少，所以pH值没有发生明显的升高。只在培养的初期有所升高，后来由于发酵过程中有机酸的生成，培养液pH值有所下降。

2.4 耐酸性实验结果

图6的结果表明，在pH值2.0的极端酸性条件下(无论培养基中是否含有L-MSG)，该菌均有一定的酸耐受能力，能耐受极端酸性环境4～6 h。为该菌做为可应用于食品工业的乳酸菌奠定了基础。

对照组菌株的酸耐受能力比发酵组菌的酸耐受能力强。不同时间对照组和发酵组菌的存活率值之间有显著性差异(表1)，但培养2h后的菌存活率之间没有显著性差异，说明在最初的培养阶段二者都在适应酸性的环境，继续培养一段时间后，对照组菌的存活率比发酵组菌的存活率高，呈显著性关系。对照组菌在培养2h后菌的存活率显著下降，培养2 h和培养4 h菌之间的存活率没有显著性差异，而发酵组菌随着时间的延长，菌的存活率显著下降。以上两种结果的产生可能与L-MSG诱导生成GAD酶有关，使得菌酸耐受能力增强。

图6 短乳杆菌NCL912的生存曲线

表1 酸应激条件下菌的存活率

2.5 GAD酶的活性分析

表2的结果表明，初始pH 4.0的培养基培养的菌的GAD酶活力最高。对照组和发酵组的不同酸性pH培养基培养的菌，其GAD酶活力有显著性差异(P＜0.05)。

GAD是催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成GABA的唯一酶。GAD酶的活性在pH＜5.5的时候得到激发。同时培养基中的L-MSG可能会诱导产生GAD酶，这是在低pH下GAD酶活力较高的原因。

表2 GAD酶活性分析

3 讨论

GABA是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质［9］，具有多种的生理功能。GAD是生物催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成GABA的唯一酶。研究表明，当培养基pH值降低时，一些细菌可以在一定范围内，依靠体内稳态机制保持pH值相对稳定而存活。在原核微生物中，GAD与细菌生长的耐酸机制有关。主要是通过GAD和相关的Glu/GABA反向转运子协同发挥作用。乳酸菌细胞通过特异的转运体将外源谷氨酸或盐转运到细胞内，在GAD作用下脱羧，不可逆的消耗了细胞内的H+。反应产物GABA，通过反向转运体被排出胞外。最终结果是胞内H+的消耗导致胞内pH值升高，胞外的谷氨酸被转变成碱性略强的GABA，导致胞外pH值升高，从而维持了pH 值的相对稳定，使细菌得以存活［7，10］。

从本文实验结果可以看出，当培养基中有L-MSG存在的情况下，该菌的生长情况较培养基中无L-MSG的培养基培养的菌生长及耐酸性好，pH值4.0对照组培养基培养的稳定期菌液的吸光度是发酵组菌液吸光度的1.61倍，不同时间对照组和发酵组菌的存活率值之间有显著性差异(P＜0.05)，说明对照组菌的耐酸性强。pH 3.5～5.0时，细菌可以完全利用培养基中添加的L-MSG，在GAD的作用下生成GABA，GABA 的产量分别达 10.77，11.44，10.94g/L，并使得培养液pH值上升，这说明短乳杆菌NCL912能够在酸性环境中生长的原因之一是与GABA的生成有关。由于GABA的生成，使得细胞内外的pH值维持了平衡，提高了细菌在低pH值下的生存能力。另外，耐酸性实验和GAD酶活力实验表明L-MSG与GAD酶的高表达有关，含有L-MSG的培养液的菌的酶活力比不含有L-MSG的培养液的菌的酶活力高，而且有显著性差异(P＜0.05)。由此可见，该菌的耐酸机制之一可能是谷氨酸-GABA对向运输机制。

本实验研究的短乳杆菌NCL912不仅能高产GABA，而且能在低pH的环境中生长，并能耐受一定时间(4～6 h)的极端酸性环境(pH 2.0)，说明该菌能够在胃肠道的酸性环境中生存而发挥有益宿主健康的功效，可以应用于食品工业，具有巨大的市场潜力和广阔的应用前景。

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The Acid Resistance of Lactobacillus brevis NCL912

Huang Gui-dong1，2，Li Chao-bo1，Cao Yu-sheng1
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)2(Food Bioengineering College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

The growth of Lactobaillus brevis NCL912，a γ-aminobutyric acid high-yielding strain，in acid environment and its acid tolerance in extreme acid environment(pH 2.0)were investigated in this paper.Meanwhile，the comparision of the growth，acid resistance，the yield of γ-aminobutyric acid and glutamate decarboxylase activity were determined in the media with and without the addition of L-glutamate sodium(L-MSG).The results showed that Lactobaillus brevis NCL912 could grow at pH ＞3.0，grow well at pH 5.0，and could survive for more than four hours at pH 2.0.The addition of L-MSG can enhance the growth of the strain.L-MSG was converted completely to γ-aminobutyric acid at pH4.0.In addition，the survival percentage(%)and the glutamate decarboxylase activity in the media with and without L-MSG were significantly different(P ＜0.05).The survival percentage(%)and the glutamate decarboxylase activity were better in the media with L-MSG.It was implied that the acid resistance of Lactobaillus brevis NCL912 was related to glutamate-γ-aminobutyric acid antiporter system.

Lactobacillus brevis NCL912，L-glutamate sodium，γ-aminobutyric acid，glutamate decarboxylase

硕士研究生(曹郁生教授为通讯作者)。

2010－05－27，改回日期:2010－11－01