鱼片干辐照加工处理的鉴别

刘晨晨，张虹，戴志远，梁新乐

(浙江工商大学食品科学与生物工程学院，浙江杭州，310035)

鱼片干辐照加工处理的鉴别

刘晨晨，张虹，戴志远，梁新乐

(浙江工商大学食品科学与生物工程学院，浙江杭州，310035)

以鱼片干为研究对象，采用高效液相色谱-荧光检测法研究酪氨酸含量与辐照杀菌处理的关系。建立了样品提取、分离和浓缩的前处理方法和液相检测方法，并提出以邻酪氨酸和对酪氨酸含量的比值作为判定样品是否辐照的标准。方法检出限为16.6～21.0 ng/mL。对酪氨酸和邻酪氨酸在16～3 800 ng/mL内均具有良好的线性关系(R2=0.999 7～0.999 9)，样品加标回收率(n=3)分别为82.7%～98.3%和83.3%～93.8%，相对标准偏差(RSD)＜7.8%。

鱼片干，高效液相色谱，辐照，邻酪氨酸，对酪氨酸

食品辐照技术是20世纪发展起来的一项灭菌保鲜技术［1－3］，在粮、蔬、果、肉、调味品、中药等领域已有应用。我国辐照食品产量已占全球总量的1/3，并具备辐照食品分类的相关卫生标准和工艺标准。2009年我国发生了2例因钴(60Co)放射源机械故障引起的辐照室内货物自燃事件;同年，某品牌方便面调料包因没有标注国标规定的辐照标识而遭到消费者的起诉。至此，辐照食品的营养和卫生安全性问题一跃成为消费者关注的焦点。食品经辐照处理后会发生生物、物理和化学变化［4］，国际上对辐照食品的安全问题也一直存在争议，相关辐照食品的检测方法也有待完善。因此，研究简便、快捷、准确的检测方法，对制定相应的辐照食品分析技术标准具有重要意义。

富含蛋白质的食品在辐照过程中产生微量的邻酪氨酸，通过检测该类食品中邻酪氨酸的含量可以判定食品是否经过辐照处理。早期，邻酪氨酸的检测主要是通过将样品酸水解，衍生化或直接经反相高效液相色谱分离检测［5－8］。原有的方法存在衍生化产物不稳定、试剂昂贵、检测条件极端、缓冲盐体系易损伤色谱柱等缺点。此外，酸水解还会带来诸如基质复杂化、重现性差、强酸性样品溶液缩短色谱柱寿命等问题［9］。Hein等人［10］在对辐照虾肉的研究中发现，通过检测游离邻酪氨酸可以避免酸水解带来的诸多问题。本文以鱼片干为研究对象，对样品中游离酪氨酸及其异构体的提取、分离、检测方法进行研究，旨在建立一套样品前处理和检测方法，为鱼片干类样品的辐照鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

各品牌鱼片干购于杭州华润万家超市、欧尚超市和世纪联华华商超市。鱼片干粉碎后于－18℃密封保存。

盐酸、氢氧化钠(分析纯)，DL-邻酪氨酸(DL-otyrosine，简称 o-tyr) ＞ 98%(Alfa aesar)，DL-间酪氨酸(DL-m-tyrosine，简称 m-tyr):购于 Sigma 公司，L-对酪氨酸(L-p-tyrosine，简称 p-tyr)，纯度＞99%购于上海生工;甲酸、甲醇、乙酸(色谱纯，美国Merck)，超纯水(Millipore)。

1.2 仪器与设备

AL204分析天平(瑞士Mettler Toledo梅特勒-托利多公司)，90-2定时恒温磁力搅拌器(上海精科实业有限公司)，高速粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)，循环水式多用真空泵(郑州长城科工有限公司)，NEOCOOL冷冻干燥机(日本yamato科技公司)，Sorvall RC-6 Plus离心机(美国 Thermo公司)，Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，带Waters2996荧光检测器，Milli-Q纯水装置(美国MILLIPORE公司)，Empowers色谱工作站，0.45μm微孔滤膜(杭州英谱科技发展有限公司)，KQ-5200E超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

1.3 色谱条件

色谱柱:汉邦，C18(250 mm ×4.6 mm，5μm);梯度洗脱(表1)，流动相:甲醇(含0.2%甲酸)(A)+水(含0.2%甲酸)(B):柱温:30℃;流速:0.8mL/min;进样量:5.0μL;荧光检测器激发波长:275nm。发射波长:305 nm。

表1 梯度洗脱程序

1.4 标准曲线制作

分别准确称取 p-tyr、m-tyr、o-tyr标准品0.003 2、0.004 1、0.003 8 g，加0.2%甲酸水溶液溶解，于200mL容量瓶中定容，配成 p-tyr、m-tyr、o-tyr浓度分别为:1.60×104、2.05×104、1.90×104ng/mL 的标准储备液，-18℃冰箱保存。分别移取1mL储备液，于100mL容量瓶定容，加0.2%甲酸水溶液定容，配制成6个不同浓度的混标溶液。

1.5 样品处理

准确称取3.00 g试样于50mL烧杯中，加入30mL0.2%甲酸水溶液，室温下磁力搅拌2h(避光操作)，抽滤，收集滤液，用10%NaOH调pH值至中性，冷冻干燥。冻干后样品复溶于0.2%甲酸水溶液5mL，13 000 r/min 离心 20 min，上清液过 0.45μm 微孔滤膜，待液相色谱检测。

2 结果与讨论

2.1 提取条件选择

由于目标物质易溶于甲酸，选择甲酸水溶液与文献中使用的溶剂0.1mol/L HCl为提取溶剂。各称取3.00g粉碎的鱼片干样品于50mL烧杯中，分别加入30mL 0.2%甲酸(FA)水溶液、0.1mol/L HCl，按1.5所述所述方法进行提取，利用高效液相色谱法测定各酪氨酸异构体含量，重复3次。提取效果如表2所示。

表2 提取效果比较

从表2中可以看出，0.2%FA的提取效果略优于0.1mol/L HCl，故采用前者作为提取溶剂。

以0.2%FA 作提取溶剂，按照(g∶mL)1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15 的料液比提取目标物质，最终确定最适料液比为1∶10。

按照1.5所述方法，比较了搅拌时间30 min、1、1.5、2、2.5、3 h对提取效率的影响，确定最佳提取时间为两个小时。

2.2 流动相的选择

酪氨酸的溶解度受pH值影响很大，其在常规色谱柱上的保留时间较短。以往常用的缓冲盐体系为流动相虽能达到有效分离，但对色谱柱造成损伤，仪器的清洗也较为复杂;用甲酸和乙酸为流动相代替缓冲盐减少对色谱柱的损伤，简化仪器清洗程序，同时可较好地增加目标物溶解度、改善峰型、提高分离度。本研究分别在流动相中加入一定比例的甲酸和乙酸，比较其效果。结果表明，相同浓度下甲酸比乙酸的效果更好。甲酸浓度在0.9%～0.2%内时对各目标物质的保留时间影响不大。由于甲酸是强酸，考虑到色谱柱的耐受性，实验最终确定流动相甲酸浓度为0.2%。

图1 不同浓度甲醇等度及梯度洗脱色谱图

酪氨酸是弱极性化合物，其各异构体在色谱柱上的保留随流动相中甲醇含量的增加而减弱。如图1(A)、图1(B)所示，当流动相甲醇含量为25%时，ptyr、m-tyr、o-tyr的保留时间依次是:3.74、4.20、5.42 min。3种异构体在色谱柱上的保留时间很接近，分离度欠佳。当甲醇含量降至10%时，保留时间依次延迟至5.26、6.39和9.241 min。各峰间距离增大，但峰宽变大。为了进一步提高分离度，同时保证良好的峰型，最终采用了10%～25%甲醇的梯度洗脱方法，如图1(C)所示。

2.3 检测波长的选择

固定发射波长305 nm，激发波长扫描范围200～295;固定激发波长275 nm，发射波长扫描范围285～400 nm，结果如图2(A)、图2(B)所示。

2.4 方法检出限、线性范围和相关性

将1.4所配6个浓度的混标溶液按1.3所述液相条件进样，以浓度和峰面积做标准曲线，以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果如表3所示。

图2 激发波长、发射波长3D扫描图

表3 线性相关性及检出限

2.5 方法回收率和精密度

为了验证方法的准确性和可靠性，对本方法进行了加标回收试验。向阴性样品中分别添加3个浓度的o-tyrosine和p-tyrosine标准品，平行3次。结果如表4所示。

表4 加标回收率和精密度实验(n=3)

从表4中可以看出，在7.5×104～3.0×105ng/g的加标浓度下，p-tyr的平均回收率在82.7%～98.3%之间，标准偏差＜4.9%;在149～596 ng/g的加标浓度下，o-tyr的平均回收率在83.3～93.8%之间，相对标准偏差标准偏差＜7.8%。

2.6 实际样品中的检测

图3(A)、图3(B)分别显示的是已知未经辐照和已经过辐照处理的鱼片干样品色谱图。图3中未辐照组的o-tyr含量明显低于辐照组。

图3 辐照(B)和未辐照(A)样品样品游离酪氨酸液相色谱图

图4 混合标准品液相色谱图

为了更准确地制定鱼片干辐照处理的判断指标，本研究组在各大超市购买了6个品牌的鱼片干，进行相同处理，对游离酪氨酸进行分析检测。其结果如下表5所示。

表5 样品酪氨酸检测结果

由于o-tyr和m-tyr都是游离苯丙氨酸的产物，因而苯丙氨酸的浓度直接制约着产物酪氨酸的浓度［13］，所以直接以o-tyr含量判断食品是否进过辐照处理并不合理。考虑到原材料和加工工艺差异对结果的影响，分别从含量和o-tyr/p-tyr(%)比值上比较辐照和未经辐照的样品。由于o-tyr占总酪氨酸的比例很小，因此可以近似认为o-tyr/p-tyr比值的增加等同于 o-tyr含量的增加。Makoto Miyahara［7］等人在对辐照猪肉、牛肉、鸡肉和金枪鱼中蛋白态o-tyr的研究中发现，鸡肉o-tyr的本底值明显高于其他3个样品，且其在相同辐照剂量下o-tyr的增加也明显高于其余样品，这说明品种间存在较大的差异性。在10kGy(60Co，6 kGy/h)剂量下，4种样品的otyr含量增加至原来的2～3倍。Wolfgang，Thomas［10］等人研究虾中游离o-tyr，未辐照虾肉中游离otyr含量为 0.0561mg/kg、1.0、3.0，5.0 kGy 剂量下(137Cs，0.7 kGy/h)o-tyr含量分别是未辐照组的3.9、7.4、11.1倍。本研究中辐照组o/p=0.434%，是未辐照处理组(o/p=0.074 3%)的5.9倍，与文献报道结果类似。表5中，1号、2号、3号、6号4个品牌样品o/p比值在3.15～5.71，5号、6号样品的o/p比值分别是0.56和0.78。综合结果，可以认为o/p＜0.10%的鱼片干是未经辐照加工的，并以此作为判定鱼片干未辐照的标准。即1号、2号、3号、6号样品被判定为阳性样品。对于各阳性样品间o/p比值的差异，可能受样品种类、辐照计量、时间和温度等因素的影响［11－12］。

Krach［11］等人在研究火鸡香肠、蛋清和蛋黄中游离酪氨酸时发现，辐照能同时增加m-tyr和o-tyr的含量，相同剂量时m-tyr的含量均明显低于o-tyr［12］。在以上4个样品中也能检出微量的m-tyr，这一结果与本文研究结果一致。但是，m-tyr含量与o-tyr和p-tyr没有明显的计量关系，因此，只能作为定性判断辐照与否的参考，而o-tyr和p-tyr的比值可以作为判断辐照与否的依据。

3 小结

辐照引发鱼片干中邻酪氨酸含量的增加，其与对酪氨酸的比值明显高于未辐照组，通过测定该比值可鉴定鱼片干是否辐照。本文建立了一套包括游离氨基酸提取、分离和浓缩的样品前处理方法和液相检测方法。通过对辐照和未辐照样品的检测以及含量比较，判定o/p＜0.10%的鱼片干是未经辐照加工的。与以往研究相比，本文首次采用甲酸水溶液作为提取溶剂，提起效果优于常用的0.1mol/L HCl;HPLC分析方法中甲酸水溶液作为流动相兼具增加溶解度和抑制拖尾的效果，同时还可能降低使用缓冲盐体系流动相对色谱柱和仪器的损伤。该方法操作简单、准确度高，可用于鱼片干类食品辐照的鉴定，为食品质量与安全的监督管理提供了有效的检测方法。

［1］王守经，于子厚.浅谈我国肉及肉类制品辐照加工业的发展［J］.核学农报，1999(2):120－123.

［2］胡鹏，徐同成，王文亮.辐照技术在食品加工中的应用研究［J］.农产品加工，2008(12):48－50.

［3］张奇志，王文亮，孙宏春，等.我国辐照食品的研究现状及发展前景［J］.中国食物与营养，2007(2):30－31.

［4］Solos J N，Belk K E.Smith G C.Processes to reduce conta mination with pathogenic microorganisms in meat［J］.Congress Proceedings of the 45 ICOM ST，1999(2):596－605.

［5］Karam L R，Simic M G.Health impact:Identification and dosimetry of irradiated foods［C］.Report of WHO working group，WHO，Denmark，Copenhagon，1988.

［6］Meier W，Hediger H.Detection methods for irradiated foods［M］.Cambridge Royal Society of Chemistry，1996.378.

［7］Makoto Miyahara，Hitoshi Ito，Akiko Saito，et al.Detection of Irradiation of Meats by HPLC determination for otyrosine using novel laser fluorometric detection with automatic pre-column reaction［J］.2000(46):304－309.

［8］Meier W，Burgin R，et al.Analysis of o-tyrosine as a method for the identification of irradiated chicken and the comparison with other methods(analysis of volatiles and Esr-Spectroscopy)，Radiat Phys Chem，1990(35):332－336.

［9］Ibe FI，Grinter R，Massey R，et al.Detection of o-tyrosine in irradiated chicken by reverse-phase HPLC and fluorescence detection［J］.Food Addit Contam，1991(8):787－792.

［10］Wolfgang，G，Hein T J，Simat H S.Determination of non-protein bound o-tyrosine as a marker for the detection of irradiated shrimps［J］.Eur Food Res Technol，2000(210):299－304.

［11］Krach C，Sontag G，Solar S，et al.HPLC with coulometric electrode array detection determination of o-and mtyrosine for identi?cation of irradiated shrimps［J］.Z Lebensm Unters Forsch A，1997(204):417－419.

［12］Krach C，Sontag G，Solar S.A simple chemical method for identification of irradiated industrial processed food［J］.Food Research International.1999(32):43－47.

Identification of Irradiation Treatment of Dried Fish

Liu Chen-chen，Zhang Hong，Dai Zhi-yuan，Liang Xin-le
(College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

This paper investigated the relationship between tyrosin composition and irradiation sterilized dried fish.The tyrosin composition was determined by high performance liquid chromatogram－fluorescence detector.The method of sample preparation was also developed，including extraction，separation and concentration.The ratio of ptyr and o－tyr was used to identify whether sample was irradiated.The detection limit was 16.6～21.0 ng/mL.The linear range was from 16 ng/mL to 3 800 ng/mL，and linear correlation was good(R2=0.999 7～0.999 9).Recovery of o-tyrosine and p-tyrosine were 82.7% ～98.3%and 83.3%～93.8%，respectively.The relative standard deviation was less than 7.8%.

dried fish，high performance liquid chromatogram，irradiation，o-tyrosine，p-tyrosine

硕士研究生(张虹教授为通讯作者)。

2010－09－17，改回日期:2010－10－03