鱼腥藻藻蓝蛋白作为食品着色剂的稳定性研究

杨立红，阮新，曲慧鸽，冯培勇，胡晓明

1(鲁东大学生命科学学院，山东烟台，264025)2(烟台进出口检验检疫局，山东烟台，264000)

鱼腥藻藻蓝蛋白作为食品着色剂的稳定性研究

杨立红1，阮新2，曲慧鸽1，冯培勇1，胡晓明1

1(鲁东大学生命科学学院，山东烟台，264025)2(烟台进出口检验检疫局，山东烟台，264000)

以鱼腥藻为材料，提取得到了纯度为A620/A280=1.958的藻蓝蛋白，研究了该藻蓝蛋白作为食品着色剂在应用中的保藏条件及食品添加剂对其稳定性的影响。实验结果表明:作为食品着色剂的藻蓝蛋白在保藏中，温度、光照及pH值对其稳定性均有一定影响，保藏条件为:pH中性、低温避光保存。不同食品添加剂对藻蓝蛋白稳定性有不同的影响，糖、苯甲酸、维生素C、赤藓醇可以提高藻蓝蛋白的色泽，乙醇、柠檬酸、山梨酸钾、肌醇、硫酸镁、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠可使藻蓝蛋白的色泽减弱。

鱼腥藻，藻蓝蛋白，食品着色剂，稳定性

藻蓝蛋白(Phycobiliprotein)是某些藻类特有的重要捕光色素蛋白，白呈现出鲜艳的宝石蓝色，又可以作为天然色素被广泛应用于食品工业中。藻蓝蛋白作为食品着色剂不仅避免了人工合成色素对人体的伤害，同时它具有在抗辐射、抑制肿瘤、抗氧化、增强免疫力等方面具有较高的活性［1－3］。我国规定藻蓝蛋白作为食品着色剂，可用于果冻、糖果、奶酪、果汁(味)饮料类、雪糕和冰棍等食品中，但由于藻蓝蛋白的色泽具有不稳定性，使用时会受到防腐剂、酸度调节剂及营养强化剂等不同食品添加剂及保藏条件的影响，而使之在作食品着色剂的应用上受到限制。本文对常用食品添加剂对藻蓝蛋白色泽的影响及其最佳保藏条件进行了研究，旨在为藻蓝蛋白作为天然色素在食品工业中得到更加广泛的应用提供理论依据。

目前作为着色剂使用的藻篮蛋白绝大部来自螺旋藻［4］，但螺旋藻需在碱性环境(pH11)下生长，在培养过程中需添加大量NaHCO3，不仅增加成本，同时产品中残留的NaHCO3不易去除干净，不适合作食品添加剂等使用。鱼腥藻(Anabeana)属淡水藻，pH条件适中，培养中不需添加NaHCO3，生产成本低，操作简单，生长速度快、产量高，一年四季均可生产，产物不含任何有害物质。且鱼腥藻藻蓝蛋白含量(9%左右)与螺旋藻藻蓝蛋白含量(10%左右)相当［5］，所以鱼腥藻是一种价廉易得的藻蓝蛋白原料资源。

1 材料、试剂与仪器

鱼腥藻藻种为水华鱼腥藻(编号为VTEX－131444，无毒)，中科院武汉水生研究所提供，由本实验室自行培养。

柠檬酸、肌醇及维生素C等试剂均为国产分析纯。

UT－2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司;高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司。

2 试验方法

2.1 鱼腥藻藻蓝蛋白提取制备

鱼腥藻藻蓝蛋白(Anabaena Phycocyanin)的制备，按杨立红等［3］的方法。测定藻蓝蛋白样品溶液在波长为750 nm、650 nm、620 nm、615 nm、280 nm 处的光吸收值后，根据:C=［(A615－A750)－(A650－A750) ×0.474］/5.34［8］计算出藻蓝蛋白的含量，按纯度=A620/A280计算藻蓝蛋白的纯度。藻蓝蛋白色泽强弱由其特征光吸收值(即A620nm值)大小判断，A620nm值越大色泽越深，反之越浅。

2.2 温度、光照及pH值对藻蓝蛋白色泽的影响

取9个试管分3组，分别加入浓度为0.110mg/mL的蓝蛋白溶液8mL，包裹上2层黑色塑料袋使其不透光。将3组试管分别置于4、25、35℃下，每隔24 h测定每个试管中藻蓝蛋白溶液在A620nm处的光吸收值，计算每组试管吸光值的平均值，绘制其变化曲线。取9个试管分3组，分别加入浓度为0.110mg/mL的蓝蛋白溶液8mL，将3组试管分别在20℃条件下避光(黑色塑料袋2层包裹)、自然光、强光(15 W日光灯，距离20cm直射)放置。每隔24 h测定每个试管中藻蓝蛋白溶液在A620nm处的光吸收值，计算每组试管吸光值的平均值，绘制其变化曲线。取10支试管，分别加入pH值2～11的PBS缓冲液8mL，各管分别加入等量的藻蓝蛋白，混匀。测定溶液在A620nm处的吸光值。同样操作重复3次，取吸光值的平均值，绘制吸光值的变化曲线。

2.3 食品添加剂对藻蓝蛋白色泽的影响

2.3.1 糖、乙醇对藻蓝蛋白色泽的影响

取27支试管分9组，每组试管中分别加入浓度为0.110mg/mL的藻藻蓝蛋白溶液8mL，在1～8组试管中分别加入适量蔗糖，各组糖的浓度分别为为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，第 9 组试管为不加蔗糖的对照管，室温(25℃)避光放置，每隔1d测定每个试管中藻蓝蛋白溶液在A620nm处的光吸收值，计算每组试管吸光值的平均值，绘制其变化曲线。方法同上，取27个试管分9组，每组试管中分别加入浓度为0.110mg/mL的藻藻蓝蛋白溶液8mL，在1～8组试管中分别加入等体积的乙醇2mL，使之各组乙醇的浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，第9组试管为对照组。

2.3.2 防腐剂、酸度调节剂及营养强化剂对藻蓝蛋白色泽的影响

选择2种常用的食品防腐剂，即山梨酸钾和苯甲酸。参考国家规定，山梨酸钾在果汁饮料和果冻中最大使用量是0.5 g/kg，苯甲酸在果汁饮料中最大使用量是1.0 g/kg［7］。取9支试管，各加入浓度为0.110mg/mL的藻蓝蛋白溶液8mL，分3组，第1组试管中各加入山梨酸钾4.0mg，第2组试管各加入苯甲酸8.0mg，第3组为对照组。室温(25℃)避光放置，每0.5 h测定各管中藻蓝蛋白溶液在A620nm处的吸光值。绘制其变化曲线。方法同上，选择常用的食品酸度调节剂柠檬酸，参考国家规定，柠檬酸在果汁类中的使用量一般为0.1%～0.3%［9］。取12支试管，各加入浓度为0.110mg/mL的藻蓝蛋白溶液8mL，分4组，1～3组试管中各加入柠檬酸，使之柠檬酸浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%。第4组试管为对照组。选择常用的营养强化剂VC、肌醇、MgSO4。维生素C在强化饮料及乳饮料中使用量为120～240 mg/kg，肌醇在饮料中的使用量为25～30 mg/kg，MgSO4在矿物质饮料中最大使用量为50 mg/kg［7］。取12支试管，各加入浓度为0.110mg/mL的藻蓝蛋白溶液8mL，分4组。第1组试管中加入维生素C 1.92mg，第2组试管中加入肌醇0.24mg，第3组试管中加入Mg-SO40.4mg，第4组为对照组。测定方法同上。

2.3.3 甜味剂、增稠剂和膨松剂对藻蓝蛋白色泽的影响

赤藓糖醇是低热量甜味剂。可用于糖果、软饮料中，最大使用量为3%，羧甲基纤维素钠做增稠剂。在饮料中最大使用量是1.2 g/kg，常用化学膨松剂碳酸氢钠，我国规定可用于各类需添加膨松剂的食品中，使用量一般为0.3%［7］。取12支试管，各加入浓度为0.110mg/mL的藻蓝蛋白溶液8mL，分4组。第1组试管中加入赤藓糖醇240mg，第2组各加入羧甲基纤维素钠9.6mg，第3组试管中加入NaHCO324 mg，第4组为对照。测定方法同2.3.2。

3 结果

3.1 鱼腥藻藻蓝蛋白的含量及纯度测定结果

采用1.1方法提取的鱼腥藻藻蓝蛋白的含量为3.61mg/mL，纯度为A620/A280=1.958。符合食品着色剂纯度(A620/A280＞0.7)要求。

3.2 温度、光照及pH对藻蓝蛋白色泽的影响结果(图1－3)

从图1可以看出，保存温度对藻蓝蛋白色泽的变化有明显的影响。保存到第7天，4℃低温条件下，藻蓝蛋白A620nm下降了14.2%，室温(25℃)和35℃ 分别下降了68%和86.8%。保存温度越低，色泽减弱程度越小，反之则越大。，黑暗和自然光下2d时(图2)，A620nm吸光值均下降了7%，强光下下降了13%;5d时，黑暗和自然光分别下降了34.1%和40.1%，强光下降了73.7%。随着保存时间增加，在强光照射下，藻蓝蛋白变化最大。由此可看出，避光和自然光对藻蓝蛋白色泽减弱程度较强光直射对藻蓝蛋白色泽减弱程度小。在pH值4～7条件下A620nm处吸光值变化较小(图3)。在pH值2～3酸性条件下A620nm处吸光值下降了约84%，在pH值8～11碱性条件下藻蓝蛋白溶液A620nm明显降低，pH值8下降了约36%，pH值9下降了43%，pH值10下降了86%，pH值11下降了92%，其最适pH值在5.0附近。在pH值4～7的均可使用藻蓝蛋白做着色剂。

3.3 食品添加剂对藻蓝蛋白色泽影响的测定结果

3.3.1 糖、乙醇对藻蓝蛋白色泽的影响测定结果

图1 温度对藻蓝蛋白色泽的影响

图2 光照对藻蓝蛋白色泽的影响

图3 pH值对藻蓝蛋白色泽的影响

糖、乙醇对藻蓝蛋白色泽的影响测定结果见图4和图5。

图4 糖对藻蓝蛋白色泽的影响

图5 乙醇对藻蓝蛋白色泽的影响

从图4可以看出，与对照相比，含有不同糖浓度的藻蓝蛋白在保存相同时间后其色泽均有不同程度的增加，保存6 d时，糖浓度由5%增加到40%，藻蓝蛋白A620nm值增加率从5.1%逐渐提高到37.3%，由此可见，糖对藻蓝蛋白的色泽有增强作用。且随糖浓度增大对藻蓝蛋白色泽的增强作用越大。与对照相比，藻蓝蛋白在不同浓度的乙醇中的色泽随着乙醇浓度的增加均逐渐减弱(图5)。7 h时，乙醇体积分数从5%增加到40%过程中，A620nm吸收值下降率依次为 0.35% 、3.44% 、7.36% 、11.04% 、20.7% 、27.6% 、45.9%和58.3%。因此，若将藻蓝蛋白加入含乙醇的饮料中，应考虑乙醇浓度不宜超过15%，即可保留藻蓝蛋白色泽的90%以上。

3.3.2 防腐剂、酸度调节剂及营养强化剂对藻蓝蛋白色泽的影响的测定结果

图6 防腐剂对藻蓝蛋白色泽的影响

图7 柠檬酸对藻蓝蛋白色泽的影响

从图6可以看出，与对照相比，山梨酸钾使藻蓝蛋白的色泽减弱，A620nm吸光值最大降低率为3.31%。苯甲酸使藻蓝蛋白的色泽增强，其A620吸收值增加率为6.82%，。因此，在应用藻蓝蛋白作为着色剂的食品中使用苯甲酸作为防腐剂比山梨酸钾更适宜。柠檬酸浓度对藻蓝蛋白色泽有减弱作用(图7)，随柠檬酸浓度浓度增加，对其色泽的影响逐渐增大，当柠檬酸浓度为0.1%时，放置2.5 h时，A620吸收值减低率为2.36%，柠檬酸浓度0.2%和0.3%条件下，放置2.5 h时，A620吸收值减低率为67.9%和71%。柠檬酸浓度为0.1%时对藻蓝蛋白影响较小，因此，使用柠檬酸做酸度调节剂时柠檬酸的浓度不宜超过0.1%。维生素C对提高藻蓝蛋白的色泽促进作用(图8)，使藻蓝蛋白特征吸收峰A620吸收值增加，最大增加率为7.75%。肌醇和硫酸镁均使藻蓝蛋白特征吸收峰A620吸收值下降，对藻藻蓝蛋白的色泽有减弱作用，肌醇A620最大下降率为5.67%，硫酸镁最大下降率为10.1%。因此在应用藻蓝蛋白作为着色剂时不宜使用肌醇和硫酸镁作为营养强化剂，可使用维生素C作为营养强化剂。

图8 营养强化剂对藻蓝蛋白色泽的影响

3.3.3 甜味剂、增稠剂、膨松剂对藻蓝蛋白色泽的影响的测定结果

从图9可以看出，赤藓醇使藻蓝蛋白特征吸收峰A620nm吸收值增加，因而可增加藻蓝蛋白的色泽。最大增加率为7.95%。羧甲基纤维素钠和碳酸氢钠均使藻蓝蛋白特征吸收峰A620吸收值下降，最大下降率分别为15.6%和12.9%。因此在应用藻蓝蛋白作为着色剂的食品中不宜使用羧甲基纤维素钠作为增稠剂及使用碳酸氢钠作为膨松剂。

图9 甜味剂、增稠剂、膨松剂对藻蓝蛋白色泽的影响

4 讨论

本实验研究了不同保藏条件及常用食品添加剂对藻蓝蛋白作为食品着色剂的影响，结果表明，藻蓝蛋白作为食品着色剂最佳保藏条件是:pH中性条件下低温避光保存。研究表明，在影响藻蓝蛋白色泽稳定性的因素中，温度影响更为显著。其次是光照。提示人们将藻蓝蛋白用于食品着色剂中高温加热过程会对藻蓝蛋白色泽有较大的影响，因而藻蓝蛋白更适宜于作为冷饮、冰欺凌等食品的着色剂。常用食品添加剂对藻蓝蛋白色泽是稳定性的影响不同，糖、苯甲酸、维生素C、赤藓醇对藻蓝蛋白A620nm特征吸收值有增加作用，可以提高藻蓝蛋白的色泽，尤其糖对藻蓝蛋白的色泽具有明显的增强作用，这一结果与张以芳等的研究一致［4］。柠檬酸、山梨酸钾、肌醇、硫酸镁、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠对藻蓝蛋白A620nm特征吸收值有降低作用，因而使藻蓝蛋白的色泽减弱。使用这些添加剂的食品不宜使用藻蓝蛋白作为着色剂。乙醇可减弱藻蓝蛋白色泽，浓度越高，对藻蓝蛋白的色泽破坏越严重，在乙醇浓度小于15%时对藻蓝蛋白的色泽减弱程度稍小，因此在含乙醇的饮品中使用藻蓝蛋白作为着色剂应考虑乙醇浓度要适宜，不易大于15%。

对上述结果产生的原因，笔者认为，藻蓝蛋白的色泽是由蛋白及发色团共同决定的，藻蓝蛋白由载体蛋白和发色团——开链线性延展的四吡咯化合物组成，载体蛋白和发色团通过硫醚键连接，氨基酸序列分析表明，每个发色团均连接在载体蛋白的半胱氨酸残基上。每分子藻蓝蛋白含二条多肽链α和β，其分子质量大约为17～18 u，每条多肽链含一个或多个共价连结的发色团，藻蓝蛋白的色泽不单是由发色团决定的，每个发色团的光谱学特性还受构象和环境影响，例如藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白均带有藻蓝素基团，但藻蓝蛋白在620 nm处有最大吸收值而别藻蓝蛋白在650 nm处有最大吸收值 。此外，αβ单体之间的相互作用也很重要［8－9］，不同食品添加剂对藻蓝蛋白的色泽的影响很可能是这些添加剂影响了藻蓝蛋白的蛋白构象，或改变了αβ单体之间的相互作用，使其表现为在A620nm的特征发生改变，而影响其色泽。

本实验采用的鱼腥藻为无毒藻种，使用其他鱼腥藻藻种生产藻蓝蛋白用于食品着色剂中必须符合国家卫生检验标准。

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The Stability Research on the Anabaena phycocyanin as a Colouring Agent for Food

Yang Li-hong1，Ruan Xin2，Qu Hui-ge1，Feng Pei-yong1，Hu Xiao-ming1
1(College of Life Sciences，Ludong University，Yantai 264025，China)2(Yantai Exit-entry inspection and Quarantine Bureau，Yantai，264000，China)

The phycocyanin with a purity of A620/A280=1.958 was extracted from Anabaena.This research focuse on the storage conditions in which the phycocyanin was used as the colouring agent for food，and the influence on the stability of the colouring agent for food applied by the storage conditions.The results demonstrated that:the temperature，sunshine and pH had certain influences on the phycocyanin as a colouring agent for food during its storage.The best condition in which the phycocyanin functions as the colouring agent for food lied in the following factors:the phycocyanin was storaged away from the light under lower temputure in pH neutral conditions.Different food colour agents have different level of influence on the phycocyanin.Sugar，benzoic acid，vitamin C，phycite can enhance the luster of the color，and ehanol，citric acid，potassium sorbate，inositol，magnesium sulfate，and sodium bicarbonate，sodium carboxymethyl cellulose can dothe opposite.

Anabaena，phycocyanin，colouring agent for food，stability

博士，讲师。

2009－12－07，改回日期:2010－05－19