大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条研制

黄岭芳，段 霞，陈 媛，刘文娟，魏 华，赖卫华,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条研制

黄岭芳1，段 霞1，陈 媛2，刘文娟2，魏 华1，赖卫华1,*

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西中德生物工程有限公司，江西 南昌 330029)

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体(鼠源)，通过将大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，研制大肠杆菌O157:H7胶体金快速检测试纸条。通过优化实验，确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26株常见细菌交叉反应结果表明，该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311和金黄色葡萄球菌CMCC 26003有轻微交叉反应外，与其他24株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。

大肠杆菌O157:H7；胶体金；试纸条

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种常见的、重要的人畜共患致病菌。它可以引起多种疾病，如出血性结肠炎(hemorrhagic colitis)、溶血性尿路综合症(haemolytic uremic syndrome)[1-3]和血栓性血小板紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)[4]等，它的感染剂量非常低，食入不足10个细菌就可引起疾病[5]。1982年美国第一次发现E.coli O157:H7，随后在美国、英国、加拿大、日本、澳大利亚和德国等地均有此菌感染事件的报道。我国受该菌的威胁也越来越大，2005年郑州市内发现3例E.coli O157:H7感染病例[6]；据调查河南省波尔山羊的带菌率最高达到29.8%[7]；张亚利等[8]对河北省1998年1月1日至1999年12月31日住院病例进行调查，发现有41例E.coli O157:H7感染疑似病例；徐景野等[9]从2001年一名男性腹泻患者粪便中分离得到E.coli O157:H7；陈冈等[10]对上海地区4家猪场的饲料、饮水、土壤、粪便以及空气112份样品进行检测，在粪便及土壤中均有E.coli O157:H7检出，其中E.coli O157:H7总阳性率为2.68%；朱根忠等[11]对在江苏省建湖地区2008年5月至9月采集腹泻患者、家禽和家畜的粪便以及水源水、肉制品、苍蝇等836份样本进行鉴定，检出肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性标本17份；冯艳洁等[12]对秦皇岛食品中E.coli O157:H7污染情况进行监测，从220份食品中检出2株大肠杆菌O157:H7，检出2株可疑的大肠杆菌O157:H7。因此，建立快速准确灵敏的检测方法，对于诊断E.coli O157:H7引起的食物中毒及预防该菌引起食物中毒均有重要意义。

1971年Faulk等创立免疫胶体金技术以来，由于该技术有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，得到广泛的应用。本研究拟以双抗夹心为模型，研制E.coli O157:H7胶体金试纸条，并对试纸条进行灵敏度和特异性评价。

1 材料与方法

1.1 菌株与抗体

E. coli O157:H7(CMCC 44828) 中国医学细菌保藏管理中心；其他菌株为本实验保存；兔抗E.coli O157:H7多克隆抗体由本实验室制备；鼠抗E.coli O157:H7单克隆抗体 Meridian公司。

1.2 试剂与仪器

氯化金(HAuC14) 天津市福晨化学试剂厂；柠檬酸三钠 北京化工试剂公司；硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫、结合垫、PVC底板 Millipore公司；PEG20000 Simga公司；BSA 北京新经科生物公司；驴抗鼠IgG无锡中德伯尔生物技术有限公司。

紫外分光光度计 上海棱光技术有限公司；Biodot点样仪、试纸条切刀 Biodot公司；磁力搅拌器 江苏金坛市金城国盛实验仪器厂。

1.3 细菌培养

将－80℃保存E. coli O157:H7划线接种于山梨醇麦糠凯平板上，37℃培养18h后挑取典型菌落接种于液体LB培养基中，37℃摇床培养8h。长双歧杆菌等厌氧细菌划线接种于MRS平板上，37℃厌氧培养24h，挑取单菌落于液体MRS中，37℃静置培养16h。其他细菌划线接种于LB平板上，方法同E. coli O157:H7。各种菌均用生理盐水梯度稀释后进行菌落计数。

1.4 胶体金试纸条制备

1.4.1 胶体金制备

胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。将100mL 0.01% HAuCl4溶液加热煮沸，然后立即加入1.2mL 1%柠檬酸三钠溶液搅拌，溶液的颜色由浅黄→蓝色→深蓝→红色，当溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，4℃保存。

1.4.2 标记pH值的确定[13]

取7个2mL离心管，分别加入1mL胶体金溶液，用0.2mol/L K2CO3溶液将pH值分别调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，各取100μL上述不同pH值的胶体金加入96孔板中，每孔加入10μL 1mg/mL的抗E.coli O157:H7单克隆抗体，混匀，静置5min后，每孔加入20μL 100g/L NaCl溶液，混匀，室温条件下放置10min，观察胶体金颜色变化，保持红色的pH值即为合适的标记pH值。

1.4.3 最佳标记量的确定

最佳标记量以目测法确定[14-15]。将待标记的抗E.coli O157:H7单克隆抗体逐级稀释后，各取10μL加入一系列装有100μL pH8.0胶体金的离心管中，摇匀室温放置5min后，分别加入10μL 100g/L NaCl，依次按表1进行，混匀静置2h以上观察结果。保持红色的离心管中，所含最低蛋白量(稳定1mL胶体金的必须蛋白量)的120%即为实际用量。

1.4.4 封闭剂的确定

取5个50mL洁净烧杯，分别加入10mL胶体金，用0.2mol/L K2CO3溶液调节pH8.0，分别加入1mL 168μg/mL抗E.coli O157:H7单克隆抗体，搅拌30min，其他试剂按表2加入，4℃、5000r/min离心30min，沉淀用重悬液重悬。用点样仪将重悬液点样于结合垫上(8μL/cm)，真空干燥1～2h，将已纯化抗E. coli O157:H7多克隆抗体用pH7.2的PBS稀释至0.5mg/mL，点样于硝酸纤维素膜上(1μL/cm)，37℃干燥4～5h。将滤纸、样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜、吸水纸固定于PVC底板上，依次加入液体LB、PBS及108CFU/mL E. coli O157:H7培养液，10～15min后读取结果。

表2 封闭剂的确定Table 2 Design for the optimization of blocking reagents

表1 抗体最佳标记量确定Table 1 Design for the optimization of antibody label amount

1.4.5 样品最佳pH值确定

将PBS的pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，各取100μL加入试纸条中，10～15min后读取结果。

1.4.6 试纸条特异性

将培养好的各种细菌用p H 7.2的P B S稀释至107CFU/mL，分别取100μL用试纸条检测，并用pH7.2的PBS和液体LB作为阴性对照。

1.4.7 试纸条灵敏度

将E. coli O157:H7培养液用pH7.2的PBS稀释成103～107CFU/mL，分别加入试纸条中，并用pH7.2的PBS和液体LB作为阴性对照，10～15min后读取结果。

1.5 食品样品检测

市售莴苣、牛肉接种目的菌(E. coli O157:H7)和非目的菌(金黄色葡萄球菌 2 60 0 3、鼠伤寒沙门氏菌13311)，经过前增菌后，用制备的胶体金试纸条检测，以测定该方法对于食品样品的实用性。

目的菌和非目的菌按1.3节方法培养后，测量其OD600，用生理盐水将全部菌稀释至102～103CFU/mL，并用平板准确计数各稀释液的浓度，目的菌稀释液记为a液，将非目的菌各取0.5mL混匀记为b液。其他试剂按表3进行，将各组37℃摇床培养10h。取各组增菌液用制备的胶体金试纸条检测，并将增菌液涂布与山梨醇麦康凯琼脂培养基上(E. coli O157:H7为无色菌落，其他菌为粉红色或红色菌落)，以验证试纸条检测的准确性。

2 结果与分析

2.1 制备的胶体金分析

制备的胶体金紫外-可见光谱图见图1，其在535nm左右有强吸收峰。用透射电子显微镜观察颗粒大小均一，约为40nm左右(图2)。

图1 胶体金紫外扫描图Fig.1 UV-visible spectrum of colloidal gold

图2 胶体金电镜图Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

2.2 标记pH值的确定

图3结果表明，pH7.5～8.5时，胶体金仍保持原来红色，胶体金溶液稳定，其他pH值条件下的胶体金有不同程度的颜色变浅现象。本实验选择pH8.0作为标记pH值。

图3 标记pH值的确定结果Fig.3 pH for antibody labeling

2.3 最佳抗体标记量的确定

图4结果显示，8～11号管胶体金保持红色，因此14μg为稳定1mL胶体金的必须蛋白量，本实验实际用量为16.8μg/mL(抗E. coli O157:H7单克隆抗体/胶体金)。

图4 最佳抗体标记量的确定结果Fig.4 Results for the optimization of antibody label amount

2.4 封闭剂的确定

如图5所示，加入液体LB和PBS时，1号、3号、4号T线出现不同程度显色，而2号T线不显色，加入E.coli O157:H7菌液时，1～4号T线显色无明显差异。因此本实验按2号方法标记胶体金。

表3 选择性增菌实验方案Table 3 Protocol of selective enrichment experiments

图5 封闭剂的确定结果Fig.5 Results for the optimization of blocking reagent

2.5 待检样品最佳pH值的确定

待检样品的pH值对胶体金试纸条检测影响很大，当样品pH值低至5.0或高至9.0时，胶体金残留于结合垫中，导致试纸条无效(C线不显色)。阴性样品pH值在5.5、6.0、6.5、8.0、8.5时，试纸条T线呈现不同程度的显色；而pH值在7.0～7.5时，T线不显色，非特异性吸附消除，结果见图6。因此检测时应将待检样品pH值调至7.0～7.5，以避免假阳性结果。

图6 样品最佳pH值的确定结果Fig.6 Results for the optimization of pH

2.6 试纸条特异性分析

试纸条与其他24株细菌呈阴性反应，包括肠致病性大肠杆菌(EPEC) CMCC44496、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC) CMCC 44350、大肠杆菌CMCC 44102、大肠杆菌2DBE2001、阪崎肠杆菌CMCC 45401、阪崎肠杆菌CMCC 45402、福氏志贺氏菌301、福氏志贺氏菌2457、白色假丝酵母Z1、枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌BD366、金黄色葡萄球菌CMCC 26001、金黄色葡萄球菌CMCC 26002、副溶血弧菌CGMCC 1.1997、副溶血弧菌CGMCC1.1616、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC 54001、单核细胞增生李斯特氏菌CMCC 54007、长双歧杆菌NCC 2705、婴儿双歧杆菌ZDY18、短双歧杆菌C5、青春双歧杆菌LiB、嗜热链球菌G1、保加利亚乳杆菌F1、变形杆菌CMCC 49027，编号依次为1～24。与金黄色葡萄球菌CMCC26003(编号25)、沙门氏菌ATCC 13311(编号26)呈弱阳性反应，试纸条与pH7.2的PBS(编号27)和液体LB(编号28)呈阴性反应。结果见图7。

图7 试纸条特异性实验结果Fig.7 Specificity of the developed strip

2.7 试纸条灵敏度分析

本研究制备的E.coli O157:H7胶体金试纸条的灵敏度为104CFU/mL，结果见表4。

表4 试纸条灵敏度实验结果Table 4 Sensitivity of the developed strip

2.8 食品样品检测

图8 食品样品检测结果Fig.8 Detection of Escherichia coli O157:H7 in food samples

通过平板计数，确定了加入样品中的目的菌和非目的菌均为10～100CFU。通过增菌10h，牛肉组1和莴苣组1用试纸条检测均为阳性，牛肉组2和莴苣组2试纸条检测结果均为阴性，如图8所示，山梨醇麦康凯琼脂平板显示牛肉组1和莴苣组1中几乎全部为目的菌，与试纸条检测结果相符，而牛肉组2和莴苣组2中只有少数粉红色菌落，说明通过添加选择性试剂抑制了非目的菌的生长，因此用试纸条检测为阴性，从而弥补了试纸条本身特异性不足。

3 讨 论

E.coli O157:H7感染已经成为一个世界性公共卫生问题。建立快速准确的检测方法是预防该菌感染的重要手段。近年各种细菌的胶体金快速检测试纸条层出不穷。唐景峰等[16]制备了布鲁氏菌胶体金试纸条，灵敏度为3×103～5×103CFU/mL之间；辛志明等[17]制备了豚鼠气单胞菌胶体金试纸条，检测灵敏度为106CFU/mL。

蛋白质主要通过电荷吸引力、疏水作用力和共价键吸附在金表面，但离子强度、pH值及封闭剂等会破坏这3种力从而影响层析系统的性能，造成假阳性结果。本研究着重从消除这种非特异性吸附，对标记时pH值及封闭剂等进行优化，制备的试纸条与样品稀释液(pH7.2 PBS)及液体LB呈阴性反应。试纸条与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311和金黄色葡萄球菌CMCC 26003有轻微的交叉反应，这可能是由于E. coli O157:H7与这两种菌有较多的相似抗原。对制备的试纸条应用于实际样品检测有以下思路：在样品前增菌过程中添加选择性试剂选择目的菌，以弥补试纸条特异性方面的不足；试纸条与前增菌培养基、稀释液应配套使用；将待检样品pH值调至7.0～7.5。用本研究所得的试纸条检测E.coli O157:H7快速、准确，具有很好的应用前景。

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Preparation of Colloidal Gold Strip for the Detection of Escherichia coli O157:H7

HUANG Ling-fang1，DUAN Xia1，CHEN Yuan2，LIU Wen-juan2，WEI Hua1，LAI Wei-hua1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Zodolabs Biological Engineering Co. Ltd., Nanchang 330029, China)

Anti-Escherichia coli O157:H7 monoclonal antibody was labeled with colloidal gold to prepare a strip for the detection of E. coli O157: H7. Anti-E. coli O157:H7 polyclonal antibody and donkey anti-mouse IgG were dispensed on the nitrocellulose membrane as the test line and control line, respectively. The optimal conjugation was performed using 16.8μg/mL antibody at the condition of pH 8.0 and blocked with PEG20000. However, the optimal pH range for the detection was 7.0－7.5. Cross-reaction test was conducted by 26 bacteria strains. Results showed no obvious cross-reaction were observed except for the slight cross-reaction from Salmonella typhimurium ATCC13311 and Staphylococcus aureus CMCC26003.Meanwhile, the sensitivity of the developed strip was up to 104CFU/mL. Moreover, this kind of developed strip was characteristics of simple operation, rapid detection, high sensitivity and specificity.

Escherichia coli O157:H7；colloidal gold；strip

TS207.4

A

1002-6630(2010)24-0355-05

2010-08-03

科技部中小企业创新基金项目(10C26223601934)；南昌市重大产业化项目(2009)

黄岭芳(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：hlf8406@163.com

赖卫华(1968—)，男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：talktolaiwh@163.com