蓝莓类饮料中花青素的快速检测方法

宋阳成，陈玉娟，李 皓，陈小桦，陈长武，任保国

(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林 长春 130052；2.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130000；3.黔南民族职业技术学院农学院，贵州 兴义 562400)

蓝莓类饮料中花青素的快速检测方法

宋阳成1，陈玉娟2，李 皓1，陈小桦3，陈长武1，任保国1

(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林 长春 130052；2.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130000；3.黔南民族职业技术学院农学院，贵州 兴义 562400)

目的：建立蓝莓饮料中飞燕草定-3-O-葡萄糖苷及锦葵定-3-O-葡萄糖苷两种花青素类成分的高效液相色谱快速检测方法。方法：采用高效液相色谱法，使用安捷伦ZORBAX SB-C18(4.6mm×75mm，3.5μm)色谱柱，以3%磷酸溶液和甲醇为流动相，二极管阵列检测器在波长525nm处进行检测。结果：该方法对飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷的最低检出限分别为0.4ng和2.5ng，标准曲线线性良好，相关系数大于0.9984，回收率在90.2%～98.3%之间，相对标准偏差不大于1.79%。结论：该法简洁、快速且灵敏度高，适合于蓝莓类饮料中花青素的快速检测。

蓝莓；饮料；花青素；高效液相色谱法

花青素(anthocyanins)又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物[1-4]，多以糖苷的形式存在，也称花色苷[5-8]。最早且最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红[9]。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力[10-11]。有实验证明，花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有多种保健功能。最近美国的一份研究报告指出，蓝莓所含有的花青素是所有的水果与蔬菜之中含量最高的，而蓝莓的花青素最丰富的部分就是在它特有的紫色果皮部位[12]。

蓝莓学名越橘，杜鹃花科越橘属植物，是少有的蓝色食品之一。蓝莓果实营养丰富，除含有常规的糖、酸、V C。矿物元素外，蓝莓果实中还含有尼克酸、SOD、黄酮等特殊成分。VC含量是苹果的几十倍[12]，被誉为“浆果之王”，是上等的保健食品，风靡欧美各国，备受人们推崇和喜爱。蓝莓不仅营养价值高，还含有大量对人类健康有益的物质，被美国最有影响力的健康杂志称为“神奇果”。目前有实验表明，蓝莓具有增强人体免疫力、延缓衰老，预防心血管疾病、改善视力、抗肿瘤、抗氧化等作用，已经逐渐被国内学者和广大群众所接受和喜爱。蓝莓对土壤的酸度要求较高，所以全球蓝莓的种植面积十分有限，仅局限于美国和加拿大等地[13]，目前美国已形成了集栽培、贮运、加工及市场服务于一体的蓝莓产业。但随着市场需要，我国各种蓝莓汁、蓝莓饮品、蓝莓酒充斥市场，质量良莠不齐，好坏无从分辨[14]。因此建立一种快速、简便的测定蓝莓饮料质量的方法十分必要。本实验是在参考文献的基础上[15-16]，应用高效液相色谱法，同时测定飞燕草定-3-O-葡萄糖苷及锦葵定-3-O-葡萄糖苷。目前现有方法多采用150mm以上色谱柱才能达到良好分离，本实验采用75mm色谱柱即可达到分离效果，所耗费时间短，分离效果好。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蓝莓汁饮料、蓝莓果酒 市售。

甲醇 美国迪马公司；二重水 自制；磷酸(分析纯) 北京化工二厂；飞燕草定-3-O-葡萄糖苷、锦葵定-3-O-葡萄糖苷 法国Extrasynthese公司。

液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；AB135-S天平 瑞士梅特勒-托利多集团；Thermo PICO17离心机美国热电集团。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

蓝莓汁饮料：移取5mL试样(精确到0.01mL)到50mL容量瓶中，加水后超声波振荡，并定容到50mL，l4000 r/min离心5min，上清液经0.45μm水系滤膜过滤，备用。

蓝莓果酒：移取5mL试样(精确到0.01mL) 到50mL容量瓶中，加水后超声波振荡，并定容到50mL，l4000 r/min离心5min，上清液经0.45μm水系滤膜过滤，备用。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×75mm，3.5μm)；流动相：A(3%磷酸溶液)-B(甲醇)；0～10.5min，B为23%；10.5～29.1min，B为23%～26%；29.1～40min，B为26%～60%。流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测器：二极管阵列检测器，检测波长：525nm。

1.2.3 标准曲线绘制

分别精确称取飞燕草定-3-O-葡萄糖苷、锦葵定-3-O-葡萄糖苷各25mg，于25mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成两个质量浓度分别为1.0mg/mL的储备液。分别移取上述储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL到10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合标准溶液。得到5个系列质量浓度的混合标准溶液：50、100、150、200、250μg/mL，备用。在上述色谱条件下进行HPLC测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

1.2.4 液相色谱测定

在相同的液相色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。

2 结果与分析

2.1 方法前处理条件的选择

对于蓝莓汁饮料、蓝莓果酒，根据花青素的理化特性可选择水作为提取溶剂采用1:4的提取比例，并用超声波振荡10min提取，之后定容至50mL，l4000r/min离心5min，取上清液经水系滤膜即可，这可使操作更简单、提取效果更好。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 流动相

为了快速检测样品，本研究发现以3%磷酸溶液和甲醇为流动相能快速有效分离飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷，选择的色谱条件为：流动相为A(3%磷酸酸溶液)-B(甲醇)；洗脱条件为0～10.5min、B23%；10.5～29.1min、B23%～26%；29.1～40.0min、B26%～60%。此时，飞燕草定-3-O-葡萄糖苷在6.978min出峰，锦葵定-3-O-葡萄糖苷在9.294min出峰，两种成分达到完全基线分离(图1)。

图1 飞燕草定-3-O-葡萄糖苷(峰1)、锦葵定-3-O-葡萄糖苷(峰2)标准品液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of standard delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside

2.2.2 线性范围

在规定的色谱条件下，将标准溶液系列进样10μL进行测定，飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷的线性范围分别为33.68～168.40 μ g/mL和44.21～221.05μg/mL；求飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷响应峰面积的线性回归方程，其方程分别为Y=12.714X+13(r=0.9994)和Y=12.771X－13.8(r=0.9984)。符合定量要求。

表1 精密度实验结果Table 1 Results of precision experiments

2.2.3 精密度和准确度测定

质量浓度为50μg/mL的样品6次实验的结果见表1，飞燕草定-3-O-葡萄糖苷，锦葵定-3-O-葡萄糖苷的RSD分别为1.79%和1.70%。

2.2.4 回收率实验

称取含有以上花青素的样品各5份，将飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷标准溶液5mL，加入5mL水进行稀释。将稀释后的标准溶液倒入称取的5份样品中，进行测定。样品加样回收率飞燕草定-3-O-葡萄糖苷为90.2%，锦葵定-3-O-葡萄糖苷为98.3%。

2.2.5 方法的最低检测限和定量限

以进样量10μL基线噪音的3倍为最低检测限计算，飞燕草定-3-O-葡萄糖苷的最低检测限为0.4ng、最低定量限5.0ng，锦葵定-3-O-葡萄糖苷的最低检测限2.5ng、最低定量限10ng。2.3 实际样品检测

图2 蓝莓饮料液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of blueberry beverage

图3 蓝莓果酒液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of blueberry fruit wine

从图2、3结果看，此方法选择性强、重现性高，达到基线分离，能从饮料中快速地检测出飞燕草定-3-O-葡萄糖苷、锦葵定-3-O-葡萄糖苷。

3 结 论

本实验确立的检测方法简单快速、选择性强、重现性和回收率高，达到基线分离，适用于各种含有蓝莓成分的样品的分析，饮品中各种常见防腐剂、甜味剂都不影响飞燕草定-3-O-葡萄糖苷和锦葵定-3-O-葡萄糖苷的定性定量分析。

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Rapid Detection Methods for Anthocyanins in Blueberry Beverage

SONG Yang-cheng1，CHEN Yu-juan2，LI Hao1，CHEN Xiao-hua3，CHEN Chang-wu1，REN Bao-guo1(1. College of Food, JilinInstitute of Engineering and Technology, Changchun 130052, China；2. College of Life Science, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130000, China；3.College of Agronomy, Qiannan Vocational and Technical College for Nationalities, Xingyi 562400, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous determination of delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside in blueberry beverage. Methods: The anthocyanins including delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside were determined by HPLC with ZORBAX SB-C18 (4.6 mm × 75 mm, 3.5μm) as the chromatographic column, 3% phosphoric acid-methanol as the mobile phase, diode array as the detector and detection wavelength at 525 nm. Results: The detection limits of this HPLC method for delphinidin-3-O-glucoside and malvidin-3-O-glucoside were 0.4 ng and 2.5 ng, respectively. The standard curve determined by this method exhibited an excellent linear relationship with correlation coefficient larger than 0.9984. The recovery rate of this method was in the range of 90.2%－98.3%with relative standard deviation less than 1.79%. Conclusion: The established HPLC method is a simple, rapid and sensitive determination method, which is suitable for the rapid determination of anthocyanins in blueberry beverage.

beverage；blueberry；anthocyanins；high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.61

A

1002-6630(2010)24-0334-03

2010-08-02

宋阳成(1968—)，男，讲师，硕士，主要从事分析化学研究。E-mail：songyangchengsych@163.com