富锗蛹虫草菌丝体主要活性成分分析

陈宏伟，侯进慧，陈安徽，秦 杰，时加美

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018)

富锗蛹虫草菌丝体主要活性成分分析

陈宏伟，侯进慧，陈安徽，秦 杰，时加美

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221018)

以空白蛹虫草菌丝体冻干粉为材料，测定富锗蛹虫草菌丝体胞内多糖、有机锗、虫草素、SOD、蛋白质及氨基酸含量。结果显示，锗在200～300μg/mL质量浓度内，对菌丝体的主要活性成分有促进作用，浓度过大，对相关活性成分有抑制作用，不同的生物学指标所需锗的质量浓度各不相同。本研究表明，培养基中锗浓度对蛹虫草菌丝体主要活性成分有影响，适宜质量浓度的锗对蛹虫草菌丝体主要活性成分有促进作用。

蛹虫草；锗；活性成分

蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)是一种与冬虫夏草相似的药食两用真菌，集提高免疫力、抗癌、保肝、延寿等多种功效于一身[1]，深受消费者喜爱。已有研究证实虫草无性型发酵菌丝体的主要有效成份含量与野生型的有效成分含量大致相同，功效相似，甚至某些成分还高于野生虫草[1-2]。

无机锗对人体有毒，是人体非必需的元素，然而近二十多年来人们对有机锗的合成、生物活性及其应用进行了广泛的探讨。已有研究表明，有机锗是一种具有高度生物活性的物质，具有抗肿瘤、消炎与免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血脂等多重功能。对高血压、贫血、骨质疏松、感冒、癫痈、慢性萎缩性胃炎、类风湿关节炎、糖尿病、老年性痴呆症等也有一定疗效，含锗食物和药物被认为是治疗癌症和艾滋病的首选[3-8]。

真菌具有较强的生物富集和转化能力，可以将无机物转化为有机物，降低其毒性，提高其生物活性。关于金针菇、羊肚菌、灵芝、灰树花、冬虫夏草等药、食真菌的富锗研究已有相关报道[9-11]，而蛹虫草对锗的富集作用以及锗对蛹虫草相关生物学指标影响的研究尚未见报道。

本实验研究微量元素锗对蛹虫草菌丝体主要活性成分含量的影响，为进一步发挥有机锗和蛹虫草的双重功效，开发具有多种功效的蛹虫草功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富锗蛹虫草菌丝体由本实验室培养并保存，利用在培养基中加入一定浓度的二氧化锗进行液体培养，然后经离心获得湿菌丝体，经冷冻干燥获得干燥的富锗菌丝体。

GeO2(分析纯)、95%～98%浓硫酸、硝酸(分析纯)、95%乙醇 徐州市科翔化学试剂有限责任公司；邻苯三酚(分析纯) 天津市福晨化学试剂厂；考马斯亮蓝(G250)上海锐谷生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；TGL-20M离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；JA2003N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；R206B旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司，BCD-205E/B冷藏冷冻箱 青岛海尔股份有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州市安泰空气技术有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计、TAS-990原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；CW-2000超声-微波协调萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取和测定

[12]方法进行。

1.3.2 锗的测定

采用原子吸收分光光度计进行测定。分析波长为265.2nm，光谱通带宽为0.6nm，灯电流为8mA，进样体积为10μL。

锗标准曲线：按分析条件对2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL锗标准系列溶液进样10μL测定，并求回归方程。

1.3.3 有机锗含量测定

参考文献[9,11]方法并改进。将菌丝体粉碎后经透析袋透析，然后将浓缩的样品直接置于50mL坩埚内，于600℃灰化1h以上，冷却后用30mL体积分数0.5%硝酸少量多次清洗，转移至100mL烧杯中，在磁力搅拌器上边加热至60℃以下边搅拌，使坩埚内的灰化物完全溶解，离心分离沉淀，取上清液定容至50mL，待测定。

1.3.4 总锗含量测定

将菌丝体粉碎后不需透析处理，其余同有机锗测定。

1.3.5 有机锗转化率的计算

1.3.6 蛋白质含量的测定

1)取1g菌粉，加入100mL 0.25mol/L氢氧化钠溶解，在超声波仪器上处理30min，取上清液加66.2g硫酸铵至95%饱和度，置于4℃冰箱过夜。

2)取出在离心机上以4000 r/min离心10min，用乙醇-乙醚(2:1)淋洗3次，再离心取出沉淀物，放入电热恒温干燥箱干燥后，取出干燥固体，即粗蛋白。

3)将提取好的粗蛋白经透析袋透析，每天换2～3次水，使其中剩余的硫酸铵析出。

4)样品测定：考马斯亮蓝法测定。将透析后的蛋白质取出，加水至20mL，用移液管移取1mL，加蒸馏水稀释10倍，再加5mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长处比色，记录A595，与标准牛血清蛋白溶液的标准曲线比较，经回归方程计算蛋白质含量。

1.3.7 氨基酸含量分析

依据中华人民共和国国家标准，GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法进行。

称取0.1g(精确到0.0001g)样品于高温耐压水解管内，加10.0mL 8mol/L盐酸，充氮气，然后110℃水解，过滤，稀释后加缓冲液调pH值为2.2，12000r/min离心，0.45μm滤膜过滤后进样。

1.3.8 SOD活力测定

1.3.8.1 SOD的提取

取1g菌丝体，放入小烧杯中，加入10mL蒸馏水浸泡2h以上。将浸泡好的菌丝体进行超声-微波破碎，设置超声波为5s开、5s停，共超声-微波处理破碎300s，破碎后进行冷冻离心10min，10000r/min，取上清液，并将上清液定容至50mL，待测。

1.3.8.2 SOD活力的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定。将每1mL反应液中每1min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为1个活力单位。

式中：V总代表反应总体积；V样代表加入样品液的体积；V定义代表活力单位定义体积(1mL)。

1.3.9 虫草素含量的测定

样品的处理及测定：称取0.5g菌丝体放入烧杯中，加入10mL蒸馏水，然后超声波破碎30min，10000r/min，－4℃冷冻离心15min，取出上清液，剩余的残渣继续加10mL蒸馏水超声波30min，反复3次，收集上清液。将收集到的上清液50℃条件下浓缩至少于10mL，定容至10mL。0.45μm微孔滤膜过滤后10μL进样，采用高效液相色谱法测定。

HPLP法测定条件：(1)色谱柱：C18反相色谱柱；(2)流动相：15%甲醇+85% pH6.5磷酸缓冲液(Na2HPO4，KH2PO4)，0.01mol/L；(3)流速1mL/min；(4)柱温：20℃；(5)紫外检测波长260nm，10μL进样。

根据虫草素的HPLC标准图谱和回归方程计算样品的虫草素含量。回归方程为：Y=91.5645x－0.396(X为虫草素的含量/mg，Y为峰面积)。

2 结果与分析

2.1 锗对蛹虫草菌丝体胞内多糖含量的影响

图1 锗质量浓度对蛹虫草菌丝体胞内多糖含量的影响Fig.1 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the content of intracellular polysaccharide in mycelia of Cordyceps militaris

从图1可以看出，低质量浓度的锗对菌丝体胞内多糖含量的生成有促进作用，在培养基中锗浓度为200μg/mL时，胞内多糖最多，比空白提高1.18倍，当锗质量浓度大于200μg/mL时，胞内多糖含量逐渐降低。多重方差分析得知，各组间有显著差异，F=47.48＞F0.01(5,12)=5.06，锗质量浓度对胞内多糖有极显著影响。2.2 锗对蛹虫草菌丝体锗含量和有机锗转化率的影响

图2 锗质量浓度对蛹虫草菌丝体内锗含量及有机锗转化率的影响Fig.2 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on germanium content and conversion rate of organic germanium in mycelia of Cordyceps militaris

从图2可知，菌丝体内总锗、无机锗和有机锗含量都随着培养基中锗质量浓度的增大而增加，而有机锗转化率在一定锗质量浓度范围内随培养基中锗质量浓度的增大而增加，在锗质量浓度200μg/mL时，有机锗转化率达到最高，达到3.7%，然后随着培养基中锗质量浓度的增大有机锗转化率不断降低。经方差分析得知，总锗、无机锗和有机锗各组内各浓度之间都存在极显著差异(P＜0.01)，所以，锗质量浓度对菌丝体内锗含量和有机锗转化率具有极显著影响。

2.3 锗对蛹虫草菌丝体蛋白质含量的影响

图3 锗质量浓度对蛹虫草菌丝体蛋白质含量的影响Fig.3 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the protein content in mycelia of Cordyceps militaris

从图3可知，低质量浓度的锗可以促使菌丝体蛋白质的形成，当锗质量浓度在300μg/mL时，蛋白含量最高达到372.97mg/g，当锗质量浓度过大时对蛋白质的合成有一定影响，但菌丝体对锗有一定的耐受力，在锗质量浓度在500μg/mL时菌体的蛋白含量还比空白高，可见蛹虫草对锗有较好的耐受力，在实验锗质量浓度范围内可以促进蛋白质的生成。方差分析得知，F=8.049＞F0.01(5,12)=5.06，锗质量浓度对菌丝体蛋白的合成具有极显著影响。

2.4 锗对蛹虫草菌丝体氨基酸含量的影响

从表1可以看出，各锗质量浓度组对氨基酸总量和必需氨基酸含量都有影响，使氨基酸总量和必需氨基酸含量都比空白组有提高，锗质量浓度为200μg/mL时的氨基酸含量最高为33.289%，比空白提高2.49倍。锗质量浓度为300μg/mL时，必需氨基酸含量最高为11.502%，比空白组提高1.89倍，该质量浓度下，必需氨基酸占总氨基酸的比例为实验组最高，达到35.617%。当高于或低于这个质量浓度，氨基酸含量都有所降低。空白组的必需氨基酸占总氨基酸的比例是各组中最高的，高达41.796%。经方差分析，各实验组间具有显著差异(P＜0.05)。锗质量浓度对菌丝体的氨基酸含量有显著影响，在锗质量浓度300μg/mL以下时，对氨基酸有促进合成的作用，当高于这个质量浓度对氨基酸总量有抑制作用。

2.5 锗对蛹虫草菌丝体SOD活力的影响

从图4可知，在一定锗质量浓度范围内SOD活力随着锗质量浓度的增加而增加，在锗质量浓度为400 μg/mL时，菌丝体内SOD活力达到最大，在锗质量浓度500μg/mL时，菌体内SOD 活力开始降低。经方差分析，各实验组有极显著差异，F=141.98＞F0.01(5,12)=5.06，锗质量浓度在实验范围内对菌丝体SOD活力具有极显著影响。

表1 不同质量浓度锗对蛹虫草菌丝体氨基酸含量的影响Table 1 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on amino acid content in mycelia of Cordyceps militaris g/100g

图4 锗质量浓度对蛹虫草菌丝体SOD活性的影响Fig.4 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the activity of SOD in mycelia of Cordyceps militaris

2.6 锗对蛹虫草菌丝体虫草素含量的影响

图5 锗质量浓度对蛹虫草菌丝体虫草素含量的影响Fig.5 Effect of germanium dioxide concentration in the culture medium on the cordycepin content in mycelia of Cordyceps militaris

从图5及方差分析可以看出，锗质量浓度对菌丝体虫草素具有极显著影响，F=6.586＞F0.01(5,12)=5.06。锗质量浓度在300μg/mL时，虫草素含量达到最高，小于该质量浓度时虫草素含量随着锗质量浓度的增加而不断增加，当锗质量浓度高于300μg/mL时虫草素含量开始下降，但表现出对锗有一定的耐力，在锗质量浓度500μg/mL时，菌体的虫草素含量还比空白组高，是空白组的1.09倍。

3 讨论与结论

已有研究表明锗对生物体具有消炎、抗肿瘤、促进血液循环、并对糖尿病、高血压、胃炎、老年痴呆患者有治疗保健作用。其作用机理主要是通过细胞的主动吸收作用使锗进入细胞内部，并与有机羧酸络合成锗盐，从而影响细胞某些酶类的活性变化[14]。

有机锗具有高度的生物活性，可以通过生物对无机锗的富集而获得。食用菌对锗的富集作用研究还不是很多。本研究结果显示，培养基中加入适量质量浓度的锗对菌丝体蛋白质含量、氨基酸含量、虫草素含量、SOD活性和有机锗转化率都有明显的提高作用，在最适锗浓度时，蛹虫草菌丝体中所测各项活性成分含量提高的幅度较大，在所实验的锗质量浓度范围内，锗质量浓度较低或过高时，对上述各项活性成分含量也有一定的促进作用。尽管锗质量浓度不同对各种生理指标的影响不同，但总体来看，在供试实验锗浓度内，上述各种指标都比空白有明显的提高。但是，锗浓度对胞内多糖的影响有所不同，在最适浓度以外的浓度范围，胞内多糖产量都有所降低，过多的锗对菌丝体胞内多糖的产生有抑制作用，低浓度的锗对胞内多糖的产生有促进作用。这可能主要是因为，锗主要参与机体的糖代谢，与糖类的形成和淀粉的贮藏有关[15]，锗在低质量浓度下，有利于某些酶的合成和增强酶的活性，利于糖类的合成，当锗浓度过高时可能会破会正常的代谢平衡从而影响糖类的代谢，使多糖产量受到抑制。本研究显示锗质量浓度在200～300μg/mL时，对于增强蛹虫草菌丝体的活性物质含量是比较适宜的。

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Effect of Germanium in Culture Medium on Main Active Component of Cordyceps militaris

CHEN Hong-wei，HOU Jin-hui，CHEN An-hui，QIN Jie，SHI Jia-mei
(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221018, China)

Cordyceps militaris was cultured in culture containing certain level of germanium dioxide, and the contents of main active components in the C. militaris mycelia, i.e., intracellular polysaccharide, organic germanium, cordycepin, superoxide dismutase (SOD), protein and amino acids were investigated. Results showed that 200－300μg/mL of germanium dioxide in the culture promoted the content of main active components in the mycelia of C. militaris. However, higher concentration of germanium dioxide inhibited the formation of the above active components.

Cordyceps militaris；germanium；active components

S567.3

A

1002-6630(2010)24-0329-05

2010-09-07

江苏省“六大人才高峰”项目(06-G-018)

陈宏伟(1963—)，男，教授，博士，研究方向为微生物资源开发与利用。E-mail：chenhw@xzit.edu.cn