中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库的构建及鉴定

李鑫,邹毅辉,杨晓亮,李桂芳,李峰,陈芳,石国庆,高剑峰

(1石河子大学生命科学学院,石河子832003;2新疆农垦科学院畜牧兽医所,石河子832000)

中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库的构建及鉴定

李鑫1,邹毅辉1,杨晓亮1,李桂芳1,李峰1,陈芳1,石国庆2,高剑峰1

(1石河子大学生命科学学院,石河子832003;2新疆农垦科学院畜牧兽医所,石河子832000)

为了筛选中国美利奴羊与免疫反应相关的的功能基因并研究这些基因的功能,构建了以美利奴羊外周免疫器官的cDNA文库。通过提取总RNA,分离纯化mRNA并以其为模版参照ZAP Express cDNA Synthesis Kit说明书构建cDNA文库。结果表明:该文库初级库容达到了3.28×105pfu,扩增库滴度为3.8×108pfu/mL,重组率为97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之间,平均大小为1.5 kb。该文库的成功构建为后续研究奠定了分子基础。

中国美利奴羊;外周免疫器官;cDNA文库

Abstract:A cDNA library from peripheral immune organs of Merino sheep was constructed to screen genes related to Immunal Reaction and explore their functions.Total RNA were extracted from peripheral immune organs of Merino sheep and mRNA were purified to construct the cDNA library as template,according to the protocol of ZAP Express cDNA Synthesis Kit.Results showed that the cDNA library consisting of a primary contenet of 3.28×105pfu and on amplified tite of 3.8×108pfu/mL was constructed with the recombinant ratio of 97.7%.The average inserted fragments were about 1.5 kb with the majority ranging from 0.5 to 2.3 kb.It was concluded that the successfully constructed cDNA library has established a solid molecular basis for further study.

Key words:Chinese Merino sheep;peripheral immune organ;cDNA library

如何减轻牲畜传染病对于绵羊养殖业所造成的损失,一直以来都是相关科研工作者研究的热点。近年来各国学者将牲畜自身免疫系统在分子水平上抗病机理作为研究重点,由于其可以提高牲畜自身免疫力,因此其已经成为抗病育种、定向育种的一种重要手段[1]。不同品系绵羊抗病特性可能与其体内某些与免疫反应相关的基因存在密切联系,如果能够通过分子生物学方法寻找并定位这些基因,就可以为绵羊的抗病育种提供科学依据[2-6]。

对于美利奴羊与免疫反应相关基因(尤其是MHC基因)的研究方面已有报道。彭林泽等[3]应用巢式PCR-RFLP方法,对211只中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1外显子2的遗传多态性进行检测,并对基因型频率和等位基因频率进行了统计,结果表明中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DRB1基因外显子2在 SacⅠ、HinlⅠ和 HaeⅢ的酶切位点存在多态性;申红等[4]用PCR-RFLP方法对103只包虫病(细粒棘球蚴病)阴性和101只阳性中国美利奴(新疆军垦型)羊MHC-DQB1第2外显子遗传多态性进行了检测,结果表明中国美利奴(新疆军垦型)羊的MHC-DQB1基因第2外显子在MroxⅠ、ScaⅠ、SadⅠ、TaqⅠ、HaeⅢ和 MvaⅠ酶切位点存在丰富的多态性。中国科学院遗传发育研究所与石河子大学利用细菌人工染色体载体pCC1BAC构建了中国美利奴细毛羊(新疆军垦型)的基因组BAC文库[5]。文库的克隆总数约为19万个,非重组率为3.2%,平均插入片段大小约为133 kb,约7.8倍基因组覆盖率,连续多次传代培养文库实验证实文库克隆的遗传稳定性好,为研究和筛选目的基因提供了良好的平台。

cDNA文库为众多cDNA序列的集合,一个高质量的文库能包含大量基因资源和信息,这使得人们能方便快捷地筛选目的基因并对其进行深入研究[7-13]。为了筛选绵羊体内与免疫反应相关的基因,本研究利用中国美利奴羊(新疆军垦型)的外周免疫组织,提取纯化其 mRNA并反转录cDNA,连接载体构建文库,并对其主要参数进行检测,以便对该文库的质量进行评估。预期目标为构建一个扩增库滴度大于3.5×107pfu/mL,重组率大于95%,插入片段介于0.3至2.5 kb之间的中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

在新疆石河子市西部牧业公司屠宰场及新疆农垦科学院采集14只美利奴羊(新疆军垦型)的脾脏及肠淋巴结共计140份。每份切成0.8～1 g不等,置于冻存管中液氮保存。

1.1.2 构建文库试剂盒及主要试剂

cDNA文库构建试剂盒ZAP Express cDNA Synthesis Kit试剂盒购自Stratagene公司,mRNA分离纯化试剂盒Oligotex mRNA Mini Kit为QIAGEN公司产品,DPEC及总 RNA提取试剂 TRIZOL购自Invitrogen公司。酵母提取物和胰蛋白胨(OXOID),卡那霉素、四环素(索莱宝公司),IPTG和 X-Gal(科百奥公司),RNase A(MBI)。MgSO4、琼脂粉、琼脂糖及低熔点琼脂糖均购自Amresco公司,其余试剂为国产。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及mRNA分离纯化

称取中国美利奴羊(新疆军垦型)的脾脏及肠淋巴节组织块共6 g混合,放入研钵加液氮研磨粉碎,称取研磨混合物300 mg装入50 mL离心管中6 mL TRIZOL分装6个1.5 mL离心管,按照操作说明书提取总RNA,用体积百分比浓度为1%DPEC水溶解,取4.5μL溶液做甲醛变性电泳验证其完整性,取4μL稀释并测定OD260和OD280吸光度值,定量计算RNA浓度。按照QIAGEN公司Oligotex mRNA Mini Kit操作说明书,从总RNA中分离纯化mRNA。

1.2.2 cDNA双链合成

以mRNA为模板,带有 Xho I酶切位点的O1igod(T)为引物,在 AccuScript reverse transcriptase作用下转录出cDNA第1链。取2μL第1链产物电泳检测。用RNaseH消化mRNA,然后以断裂的mRNA作为第2链合成的引物,以cDNA第1链为模板,在DNA Polymerase I的作用下合成cDNA第2链。取2μL第2链产物进行电泳检测。

1.2.3 EcoR I/Xho I接头连接及柱筛选

合成的cDNA在 T4DNA聚合酶作用下补平cDNA的末端,在其两端连接 EcoR I接头,经过EcoR I末端磷酸化后进行 Xho I酶切,并通过Sepharose CL-2B gel filtration medium去除400 bp以下的片段。

1.2.4 噬菌体包装

从-80℃冰箱取出包装提取物,用手温浴包装提取物使其快速融化,将连接好的cDNA快速加入到包装提取物中,轻轻混匀上述混合物,低转速离心3～5 s,室温放置2 h。在混合物中加入500μL SM buffer和20μL氯仿并轻柔混匀,短暂离心以去除未与cDNA整合的提取物以及细胞碎片。

1.2.5 初级库容计算

在2个直径150 mm培养皿中分别铺厚度约2 mm的NZY固体培养基,并均匀涂抹 X-Gal(250 mg/mL)及 IPTG(0.5 mol/L),XL1-Blue MRF′菌株单菌落在补充培养基中振荡培养过夜培养;离心去上清,菌体用10 mmol/L硫酸镁稀释吸打混匀至OD600=0.5,取原库 2μL与 400μL XL1-Blue(OD600=0.5)菌液吸打混匀,37℃加热15 min后与8 mL的NZY顶层培养基混合均匀,上述混合物按每板201μL在制备好的NZY琼脂培养基平板上铺展,待NZY顶层培养基温度降至室温后,37℃培养6 h后计数每板噬菌斑数量。

1.2.6 文库扩增与滴度计算

在37个直径150 mm培养皿中分别铺厚度约2 mm的NZY固体培养基,挑取 XL1-Blue MRF′菌株单菌落在补充培养基中振荡,过夜培养;离心去上清,菌体用 10 mmol/L硫酸镁稀释吸打混匀至OD600=0.5,按照每5×104个噬菌斑与600μL稀释好的XL1-Blue MRF′菌液混合均匀。37℃温浴15 min后,与6.5 mL的NZY顶层固体培养基混合均匀,在一个培养皿的NZY固体培养基表面均匀铺满,37℃培养6～8 h,每个培养皿中加入8 mL SM buffer。4 ℃放置过夜,将所有 SM buffer倒入一个塑料收集瓶中,每个培养皿加入2 mL的SM buffer洗涤,加入氯仿至终体积 5%,充分混匀,4000r/min离心10 min除去细胞碎片,将上清液收集到一个新的收集瓶中,加入DMSO至体积终浓度8%,-80 ℃保存,将扩增文库按照 1∶500、1∶1000、1∶5000、1∶10000的体积稀释比例用 SM缓冲液进行稀释,即每1μL扩增库分别被稀释至5001μL,1 mL,5 mL,10 mL四个稀释梯度分别取稀释液1μL与600μL OD600=0.6的 XL1-Blue菌液吸打混匀,37℃加热15 min后,与8 mL的NZY顶层培养基混合均匀,每个梯度铺三板,在制备好的NZY琼脂培养基平板上铺展,待NZY顶层培养基温度降至室温后,37℃培养6 h后计数每板噬菌斑数量。

1.2.7 pBK-CMV载体大量剪切

为了获得并分析插入片段相关信息以便对cDNA文库质量进行评价,按照试剂盒操作手册的说明,借助辅助噬菌体将pBK-CMV载体从ZAP Express载体上剪切下来,转染 XLOLR菌株提取质粒,通过 EcoR I/Xho I双酶切从pBK-CMV嗜菌粒切下双链cDNA进行电泳验证。

2 结果与分析

2.1 总RNA浓度计算及质量鉴定

浓度测定:取4μL总 R NA溶液,加996μL 1%DEPC处理的无菌水于紫外分光光度仪中检测吸光度 ,读 数 O D260=0.434,浓度为 4 .34μg/μL,OD280=0.247,A260nm/A280nm=1.757。总RNA溶液中取4 μL在胶浓度1.0%的琼脂糖凝胶中进行甲醛变性电泳,电压5 V/cm,时间15 min,经过凝胶成像后出现28 S、18 S、5.8 S三条带,其中28 S与18 S两条带亮度比值约为2∶1,5.8 S带亮度较低,总RNA各条带未见明显降解,符合建库要求(图1)。

2.2 cDNA第1、2链的质量鉴定

cDNA的第1、2链产物各取2μL。以胶质量百分比浓度0.9%的琼脂糖凝胶电泳验证。电压5 V/cm,电泳20 min,电泳结果表明双链产物弥散带跨度较大,表明所合成的cDNA分子量较分散,范围为400～3000 bp,带型为连续弥散带,符合建库要求(图2)。

图1 美利奴羊总RNA电泳分析Fig.1 Analysis of total RNA of Merino sheep

图2 cDNA第一条链和第二条链电泳Fig.2 Analysis of cDNA of Merino sheep

2.3 cDNA文库的初级库库容量和扩增库滴度的计算

2.3.1 初级库库容量计算

初级库共得到3120μL噬菌体溶液,从每个直径150 mm含NZY固体培养基培养皿取1μL噬菌体溶液铺板,平均噬菌体数量为每板105个克隆,计算得到的初级库库容量为3.28×105pfu。

2.3.2 扩增库滴度的计算

按照1.2.6实验方法推算扩增库的平均滴度,约为3.8×108pfu/mL。

2.4 cDNA文库重组率计算及插入片段大小分析

在经过多克隆剪切后的平板上随机挑取的个白色重组子进行酶切后电泳验证,共挑取克隆63个,有1个酶切产物未见插入片段,文库的重组率为97.7%,cDNA文库平均插入片段的计算:随机挑取26个克隆,上述且大多数插入的片段为0.5～2.3 kb,平均插入片段约 1.5 kb(图 3、4)。

图3 部分随机克隆酶切图谱Fig.3 Inserts size estimation of recombinants by digestion

图4 部分随机克隆酶切图谱Fig.4 Inserts size estimation of recombinants by digestion

3 讨论

cDNA文库筛选是获取基因全长cDNA的基本方法之一。基因全长cDNA的获取是研究酶结构与功能相关基因的表达和调控、基因工程应用的重要前提。cDNA来源于细胞的mRNA,便于克隆和大量扩增,可从cDNA文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于目的基因的表达和转基因研究。近年来,随着cDNA文库构建技术的日益成熟和普及,该技术已经成为各实验室克隆相关性状基因的一种首选方法[8]。

在构建cDNA文库的过程中,目的片段与载体连接之前,cDNA小片段的删除效率的高低直接影响初始文库滴度。如果短片段不能被有效筛除,那么其将会与载体优先连接,降低文库平均插入片段长度,使文库质量降低。但如果为保证文库的平均插入片段长度而筛除过多的cDNA片段,则会造成文库的初始滴度下降,从而造成基因丢失,降低了文库的覆盖率[9]。本实验在cDNA与载体连接之前,将合成的cDNA通过Sepharose CL-2B柱,分级分离cDNA可有效去除小片段。

本研究中所选用的Stretagene公司试剂盒在cDNA第2链合成的方法上选用置换合成法而非PCR扩增法,其优点是避免了在PCR过程中因扩增效率不同而导致的mRNA合成cDNA效率的变化,这种方法对于获得一些较低拷贝数基因的克隆具有促进作用,也是我们选择该方法的主要原因。其缺点是部分降解的mRNA会使所构建文库中全长cNDA的比例下降,而且所需初始mRNA的量较大[9]。

本研究中构建文库使用的λZAP Express载体既可在真核系统中表达,又可在原核系统中表达,共有12个克隆位点,适合小于12 kb cDNA插入片段,而且插入片段以卡那霉素抗性的pBK-CMV噬菌粒载体的形式从噬菌体载体上切下,这个质粒载体多克隆位点两侧有 T7噬菌体和 T3噬菌体启动子,这有利于DNA序列分析及融合蛋白的表达,用此载体构建的cDNA文库既可用DNA探针又可用抗体探针筛选,而且便于对筛选到的阳性克隆进行测序和表达[9]。

为了快速高效筛选免疫反应相关的基因以便对其进行深入研究,我们构建了中国美利奴羊(新疆军垦型)外周免疫器官混合cDNA文库,质量评价结果表明:初级库容达到3.28×105pfu,扩增库滴度为3.8×108pfu/mL,重组率为97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之间,平均大小为1.5 kb。本研究结果表明:该文库的各项参数均达到了预期指标且质量较高。这为快速高效筛选中国美利奴羊(新疆军垦型)体内与免疫反应相关的基因奠定了分子基础。这些基因可能与不同品系绵羊抗病特性、生产性能或者经济性状存在密切相关。如果能够通过分子生物学方法对其进行寻找并定位,就可以为绵羊的抗病育种提供科学依据。

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Construction and Characterization of cDNA Library from Peripheral Immune Organ of Merino Sheep

LI Xin1,ZOU Yihui1,YANG Xiaoliang1,LI Guifang1,LI Feng1,CHEN Fang1,SHI Guoqing2,GAO Jianfeng1
(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation,Shihezi 832000,China)

S827.2;Q959.842

A

1007-7383(2010)05-0529-05

2009-04-16

科技部重大国际合作项目(2006DFB33750)

李鑫(1983-),男,硕士,研究方向为动物免疫与育种;e-mail:lxin@shzu.edu.cn。

高剑峰(1964-),男,教授,从事动物免疫与育种研究;e-mail:jianfengg@shzu.edu.cn。