牛源木糖葡萄球菌的生物学特性及耐药性分析

魏鲁予,剡根强,齐亚银,莫敏,王静梅

(石河子大学动物科技学院,石河子832003)

牛源木糖葡萄球菌的生物学特性及耐药性分析

魏鲁予,剡根强,齐亚银,莫敏,王静梅

(石河子大学动物科技学院,石河子832003)

为确定致奶牛乳房炎木糖葡萄球菌的某些生物学特性及耐药性,采用常规方法对60株木糖葡萄球菌分离株进行了检测与分析。结果显示:被测菌株血浆凝固酶均为阴性,过氧化氢酶及甘露醇发酵为阳性,8株分离菌出现β-溶血,5株对小白鼠有致病性。本次分离的木糖葡萄球菌对磺胺嘧啶(耐药率100%)、青霉素钾(耐药率93.3%)、庆大霉素(耐药率90%)、四环素(耐药率90%)高度耐药,对环丙沙星(耐药率43.3%)、氧氟沙星(耐药率46.6%)呈中度敏感。

木糖葡萄球菌;分离与鉴定;药敏试验

Abstract:To determine parts of biolgical characteristics and medicine sensitivity of Staphyloccus xylosus,60 strain Staphyloccus xylosus were examined with common methods.Results showed that examined bacteral strain were staphylocoagulase feminine,catalase and Mannitol fermentation were masculine.8 bacteral strains hadβhemolysis and 5 bacteral strains had pathogenicity.The drug sensitivity tests showed that those strains were resistant to Sulfadiazine(drug fast rate 100%),benzylpenicillin potassium(drug fast rate 93.3%),Tetracycline(drug fast rate 90%),Gentamicin(drug fast rate 90%),and medium sensitive to Ciprofloxacin(drug fast rate 43.3%),Ofloxacinmedium(drug fast rate 46.6%).

Key words:Staphyloccus xylosus;isolation and identification;resistance test

木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylose,S.xylose)是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococcus,CNS)。此菌广泛分布于自然界,以往被认为是非致病菌[1]。木糖葡萄球菌作为CNS中的一种,其致病性较弱[2]。近年来,由于抗生素的广泛应用,葡萄球菌的耐药性也逐年增强。随着介入性手段和免疫抑制剂的使用,血浆凝固酶阴性葡萄球菌也成为重要的机会致病菌,并出现多重耐药菌株[3]。在奶牛乳房炎的临床防治中,随着抗生素的滥用,凝固酶阴性葡萄球菌感染的乳房炎也不断增加[4],因此对凝固酶阴性葡萄球菌的确切认知就显得很有必要。

随着抗生素的普遍应用,治疗手段的改变,致病力弱的凝固酶阴性葡萄球菌逐渐代替了致病力强的金黄色葡萄球菌,占重要位置[4]。在引起奶牛乳房炎葡萄球菌中,报道最多的为金黄色葡萄球菌,木糖葡萄球菌报道的很少。在引起奶牛乳房炎细菌中,凝固酶阴性葡萄球菌的总体比例有逐渐上升趋势[5]。因此对引起奶牛乳房炎凝固酶阴性葡萄球菌生物学特性及耐药性监测就显得很有必要。

为了确定石河子地区奶牛场乳房炎病原菌分布情况,本实验采集了石河子部分奶牛场临床型乳房炎奶牛乳样,对其中的木糖葡萄球菌进行了分离鉴定,并检测其对磺胺嘧啶等12种常用抗生素的药物敏感性,以期为本地区奶牛乳房炎的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

分别采集北疆地区14个规模化牛场的临床型乳房炎奶样623份,分离得到172株葡萄球菌,筛选出木糖葡萄球菌60株,金黄色葡萄球菌为本实验室保存牛源金黄色葡萄球菌。

1.1.2 生化试剂

脲酶、吡咯烷酮酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸芳基酰胺酶、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖、木糖、果糖、蕈糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、木糖醇、纤维二糖、密二糖、棉子糖、松三糖等用于木糖葡萄球菌鉴定的生化鉴定培养基由石河子大学动物科技学院微生物实验室制备。

1.1.3 药敏试验

选取环丙沙星、林可霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、硫酸链霉素、红霉素、头孢拉定、阿米卡星、青霉素钾、庆大霉素、磺胺嘧啶、四环素等用于葡萄球菌药敏试验常用药物。

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌分离培养基的制备

Baird-Parker琼脂培养基:胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,酵母浸膏1.0 g,丙酮酸钠10.0 g,甘氨酸12.0 g,氯化锂(含6份结晶水)5.0 g,琼脂粉20.0 g,蒸馏水950 mL。将各成分加到蒸馏水中加热煮沸至完全溶解,冷至45～50℃,校正p H值至7.0±0.2,121℃高压灭菌15 min,4℃保存[6]。

1.2.2 葡萄球菌的分离

无菌条件下取乳汁样品各25 mL,加入至225 mL 7.5%氯化钠肉汤增菌液中,放置于37℃恒温培养箱中培养24 h,转接划线于Baird-Parker琼脂平板,置37℃培养24 h,挑取典型菌落进行革兰氏染色 ,镜 检[7]。

1.2.3 木糖葡萄球菌生化鉴定

分离纯培养的菌落经革兰染色初步判定为葡萄球菌后,其发酵葡萄糖、对新生霉素(5μg/片)和杆菌肽(0.04 IU/片)耐药、凝固酶阴性、分解木糖,进行木糖阳性CNS的种间鉴别[8],同时按梅里埃公司的葡萄球菌生化鉴定系统进行生化鉴定并做相应的补充实验。

1.2.4 血液琼脂平板培养

将普通琼脂培养基121℃高压灭菌20 min,冷却至50℃时,加入健康成年家兔的脱纤血,制成5%脱纤血琼脂平板培养基。挑选Baird-Parker培养基上的灰色(或黑色)单个菌落,划线接种于血液琼脂平板,37℃,培养24 h,观察溶血情况。

1.2.5 血浆凝固酶试验

吸取0.5 mL兔血浆与0.5 mL木糖葡萄球菌24 h肉汤培养物充分混匀,置37℃培养,每隔0.5 h观察1次,连续观察6 h,出现凝固时,将小试管倾斜或倒置时,内容物不流动,判为阳性。同时做阴阳性对照。

1.2.6 过氧化氢酶试验

在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢,挑取单个菌落放在过氧化氢中观察变化。在30 s内产生大量气泡者为阳性,不产生气泡者为阴性。

1.2.7 甘露醇发酵试验

将纯培养的各分离菌株接种于甘露醇发酵管中,置37℃温箱中培养24 h,观察分解甘露醇的情况。

1.2.8 小白鼠感染试验

将小白鼠分成15组,每组2只,选择8株具有β-溶血特性的木糖葡萄球菌和任意选取6株不具有β-溶血特性的木糖葡萄球菌分别腹腔接种小白鼠,体重15～20 g/只,每只 0.2 mL(含 5.0×107CFU细菌),1组注射生理盐水,观察小鼠反应,实验小白鼠由石河子大学实验动物中心提供。

1.2.9 药敏试验

按 K-B纸片扩散法进行药敏试验[9].将分离株分别接种LB肉汤,37℃摇床培养16～18 h。用灭菌的棉拭子蘸取摇匀的肉汤培养物,均匀的涂布到直径90 mm的MH平板表面,每一菌株涂2块平板。用无菌镊子将药敏纸片紧贴在平板表面(每块平板贴6个药敏纸片),纸片与平板内缘相距不得少于15 mm,两纸片之间的距离不得少于24 mm,37℃18～24 h后记录结果。

以药敏纸片周围没有肉眼可见生长区域为抑菌圈,根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。判定标准根据NCCLS 2004年新版标准进行判定[10]。

2 结果与分析

2.1 染色镜检结果

由图1可见,此菌为革兰阳性球菌,呈单个,成双及不规则葡萄状排列,无芽胞,无荚膜,无鞭毛。

图1 葡萄球菌革兰氏染色(100×10)Fig.1 Staphylococcus Gram staining(100×10)

2.2 血琼脂平板培养结果

经观察,分离纯培养24 h后在血琼脂平板上长出灰白色、中央凸起、边缘光滑、直径为2～3 mm的菌落。革兰染色呈散在状葡萄球菌。

2.3 菌株的生化鉴定结果

此次从临床型乳房炎奶样中分离的菌株,木糖葡萄球菌触酶阳性,发酵葡萄糖,血浆凝固酶阴性,符合CNS的一般特性。

生化反应结果:氧化酶阴性,V-P阳性,能还原硝酸盐。脲酶、吡咯烷酮酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖、木糖、果糖、蕈糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、木糖醇均为阳性,其它均为阴性。

经法国生物梅里埃API Staph(葡萄球菌鉴定条)鉴定,此次经生化鉴定的木糖葡萄球菌,符合率在98%以上。

2.4 血浆凝固酶、过氧化氢酶和甘露醇发酵试验结果

此次分离的木糖葡萄球菌血浆凝固酶均为阴性,对照组金黄色葡萄球菌为阳性;过氧化氢酶均为阳性;甘露醇发酵试验均为阳性。

2.5 动物感染试验结果

8组小白鼠在接种具有β-溶血特性木糖葡萄球菌后24 h开始出现精神萎靡,身体蜷缩,被毛逆立;48 h后,其中5组小白鼠全部死亡,死后剖检可从肝、脾、淋巴结和脑组织中分离出与病料分离株具有相同生物学特性的细菌。不具有β-溶血特性的6组中,除2组精神轻微萎靡外,无死亡,对照组小白鼠无症状。

2.6 药物敏感试验

应用12种临床常用抗生素对60株木糖葡萄球菌进行了药敏试验,结果见表1。

从表1可以看出,此次分离的木糖葡萄球菌对恩诺沙星、阿米卡星敏感,对磺胺嘧啶,青霉素钾、庆大霉素、四环素高度耐药,对环丙沙星、氧氟沙星中度敏感,对恩诺沙星,阿米卡星敏感。

表1 12种临床常用抗生素对木糖葡萄球菌的药敏试验结果Tab.1 The results of resistance test of 12 antibiotics to Staphylococcus xylosus

3 讨论

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌,约50%的奶牛乳房炎是由该菌引起。而本次研究分离的木糖葡萄球菌占葡萄球菌分离株的34.88%,在引起奶牛乳房炎的葡萄球菌中占较大比例,说明在引起奶牛乳房炎细菌中,凝固酶阴性葡萄球菌的总体比例逐渐上升,这是近年奶牛乳房炎病原菌的新特点。

木糖葡萄球菌触酶阳性,可区别于链球菌属;氧化酶阴性、发酵葡萄糖,可区别于微球菌属。在葡萄球菌致病性鉴定中,凝固酶阴性并不是致病性的重要参考因素,细菌是否具有溶血性在分析细菌致病性方面具有重要参考价值。

此次分离的木糖葡萄球菌对磺胺嘧啶青霉素钾高度耐药,而青霉素、磺胺类等目前主要用于治疗奶牛乳房炎的药物[11],对常见的致病菌抑菌效果较差,甚至无效。随着新的抗菌药物的广泛使用,将会面临新的耐药性的问题。因此有必要在给药途径、药物配合使用上进行进一步的研究,以达到有效控制本病的目的。在使用抗生素时,应避免使用氨基糖苷类和磺胺类抗生素,而选用对葡萄球菌具有较好抑菌效果的药物。

[1]Rupp P E,Archer G L.Coagulate-negative staphylococci:pathogens associated with medical progress[J].Clin Infect Dis,1994,19(6):231.

[2]路娟,仲椒英.木糖葡萄糖菌脑术后感染1例[J].中华医学检验杂志,1991,14,63.

[3]Martin de Nicols M M,Vindel A,Sacz-Nieto J A.Epidemio-logical typing of clinically significant strains of coagulase-negative staphylococci[J].J Hosp Infect,1995,29(11):35.

[4]Harmon RJ,Langlois B E.Mastitis due to coagulate negative Staphylococcus species[J].Agri Practice,1989,10:29-34.

[5]戈胜强,柴同杰,等.奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及耐药性检测[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,36(11):40-45.

[6]叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京:东南大学出版社,1997.

[7]李英奇,剡根强.新疆北疆地区临床型乳房炎病原细菌的分离鉴定[J].石河子大学学报:自然科学版,2009,27(6):56-59.

[8]徐迪诚,马俊才,王艳,等.细菌编码鉴定手册(葡萄球菌)[M].哈尔滨:黑龙江人民出版社,2000.

[9]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2002.

[10]NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,fourteenth informational supplement[J].NCCLS,Wayne,Pennsylvania,2004,24(1):151-159.

[11]Kaarina S H,Olavi E.Efficacy of parenteral administration of three antimicrobial agent in treatment of clinical mastitis in lactating cows:487(1989-1995)[J].J Am Vet Med Assoc,1998,212(3):407-412.

Biological Characteristics and Medicine Sensitive Test of Staphyloccus xylosus

WEI Luyu,YAN Genqiang,QI Yaying,MO Ming,WANGJingmei
(College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S852.611

A

1007-7383(2010)05-0572-04

2009-10-19

魏鲁予(1983-),男,硕士生,专业方向为动物传染病诊断与防治;e-mail:weiluyu2007@126.com。

王静梅(1958-),女,高级实验师,从事动物传染病诊断与防治研究。