微生物来源的昆虫几丁质酶抑制剂的筛选与分离纯化

张洪斌，刘明艳，田玉敬，胡雪芹

(合肥工业大学化工学院，安徽 合肥 230009)

微生物来源的昆虫几丁质酶抑制剂的筛选与分离纯化

张洪斌，刘明艳，田玉敬，胡雪芹

(合肥工业大学化工学院，安徽 合肥 230009)

通过对筛选条件进行优化，建立可靠的平板透明圈初筛方法和DNS比色复筛方法；以棉铃虫几丁质酶作为筛选靶标并用此筛选模型对500多株菌株进行筛选，筛选出包括A0901#菌株在内的具有几丁质酶抑制作用的活性菌株29株。采用活性追踪的方法对A0901#菌株发酵产物进行分离纯化，通过乙醇沉淀、Sevag试剂除蛋白及Sephadex G-100凝胶色谱得到一个纯的活性物质，经HPLC检测显示在保留时间15min左右为一单峰，DNS比色法验证其抑制率为54.2%，红外、质谱、元素分析表明此物质的分子式为C9H18O10，并证明其为一个多羟基的化合物。

几丁质酶；抑制剂；筛选；分离

几丁质酶广泛存在于各种微生物、动物和植物中，尤其在真菌和昆虫等的生长、繁殖和发育过程中起着重要作用[1]。几丁质酶降解几丁质，转化、产生菌体蛋白和氨基寡糖素等产物，在食品、医药、化妆及动物饲料等行业广泛应用[2]。在昆虫体内，几丁质酶在其胚后发育中扮演关键角色，尤其在幼虫蜕皮和化蛾阶段；另外几丁质酶还涉及扩大和降低中央肠围食膜基质，保护中央肠上皮组织[3]。由于昆虫的生长和发育严格地依靠其改变自身几丁质结构的能力，昆虫以高度控制的方式重复合成和降解几丁质以达到允许蜕皮和围食膜的再生[4-5]，因此阻断在几丁质降解中的关键酶——几丁质酶是理想的新型生物农药筛选模型。通过阻断几丁质酶，阻止昆虫蜕皮、化蛾和围食膜的再生，以达到杀灭昆虫的目的。而且由于几丁质不存在于脊椎动物中，因而该类药剂对人畜较为安全，因此几丁质酶抑制剂可以开发成为一种新型的绿色生物杀虫剂[6]，它对人畜安全无毒，不污染环境，不破坏农作物的色香味，可应用于作物生长的的任何时期，是食品安全的重要保证。

虽然近年来几丁质合成酶抑制剂如真菌多氧霉素都已经上市，但是关于几丁质酶抑制剂的报道还很少。迄今为止，世界上关于几丁质酶抑制化合物的相关研究大致经历了3个发展阶段：第一阶段是从微生物代谢产物中筛选作为昆虫生长调节剂和抗真菌剂的几丁质酶抑制化合物，并就其对昆虫和真菌生命活动产生的影响进行了深入研究，这个阶段以阿洛菌素的发现和对其生物合成机制的探讨为标志；第二阶段是对几丁质酶抑制剂与几丁质酶之间相互作用进行的结构学研究，这为人工设计几丁质酶抑制剂奠定了坚实的基础，这个阶段对精氨芬、阿尔加定与几丁质酶相互作用方式和空间结构的阐明为标志；目前，该领域的研究已经从筛选新的几丁质酶抑制剂发展到建立新的筛选模型和发现已知几丁质酶抑制剂的新功能[7]。到目前为止，已报道的几丁质酶抑制剂有阿洛菌素(allosamidin)[8]、酪氨酸衍生物类、生物碱类、环二肽(CI-4)、精氨芬(argifin)[9]、阿尔加定(argadin)[10]、甲基黄嘌呤药物及其衍生物、核黄素和黄素衍生物等[11]。抑制剂的来源存在于微生物、植物中，如1983 年从非洲医用植物蓝茉莉(Plumbago capensis) 中提取出的plumbagin (2-甲基-5-羟基-1,4-萘醌)能抑制4种农业鳞翅目昆虫的蜕皮[12]。

由于几丁质酶抑制剂独特的作用机制，人们利用几丁质酶抑制剂进行病虫害防治、医药生产、饲料加工的研究已越来越受到重视。本研究直接从棉铃虫蛹中提取酶，建立以平板透明圈初筛法和DNS比色法为复筛的筛选方法，从我国丰富的微生物资源中获得几丁质酶抑制化合物的生产菌株，并对其中的活性物质进行初步的分离，以期从中发现对几丁质酶具有良好抑制作用的化合物，为开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

棉铃虫购于湖北省农业科学院；菌种均由本实验室筛选保存；Sephadex G-100为Pharmacia公司产品；其他常用试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

NA培养基(培养细菌)和高氏一号培养基(培养放线菌)。

1.1.3 几丁质抑制化合物的筛选平板

1%胶体几丁质8g，琼脂粉1.5～2g，水100mL，pH7.0。

1.1.4 仪器与设备

1515型高效液相色谱仪、质谱仪 Waters公司；傅里叶红外光谱仪 Thermo Nicolet公司；WFZ800-D38紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；KDC-160H高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；HH数显恒温水浴锅 江苏金坛市晶玻实验仪器厂；SPX-150B生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；EURO EA 3000元素分析仪 Leeman公司。

1.2 方法

1.2.1 胶体几丁质的配置

称取2g几丁质，加入20mL 85g/100mL质量浓度的浓磷酸溶解，常温下放置2d后，加蒸馏水稀释，反复冲洗(采用离心分离)至pH5.0以上。离心后的几丁质沉淀用蒸馏水调整终质量浓度至1g/100mL[13]。

1.2.2 粗酶液的提取

将棉铃虫蛹于25℃培养箱培养8～10d至快要化蛾时，收集蛹于0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液中均质，冰水浴中超声1s，间歇2s，150W破碎16min，4℃、10000r/min离心30min收集上清[14]。

1.2.3 酶活力测定

以N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生成速度测定酶活性大小。50℃，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖为标准，每小时产生1μmol/LN-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)[15]。

胶体几丁质＋几丁质酶→N-乙酰-D-氨基葡萄糖

在装有预热至45℃的0.5mL 1g/100mL胶体几丁质和0.5mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)比色管中，加入0.5mL酶液，于50℃温育1h，沸水浴保持10min中止反应，将沸水浴后的酶液置于冰浴冷却，冷却后加入1.5mL DNS试剂，沸水浴20min，冷却至室温后用蒸馏水定容到25mL，摇匀，离心后取上清，以灭活的等量酶液做空白对照，在波长500nm处测吸光度，折算成酶活。

1.2.4 活性菌株的液体培养方法

活化后的菌株接种于液体培养基，细菌37℃振荡培养2d，放线菌30℃振荡培养5d，培养液6000r/min 离心10min，取上清。

1.2.5 平板透明圈法

把酶液与筛选待测液按1:2 的比例混合，在几丁质酶抑制化合物筛选平板上打孔[16]，取混合液30μL加样于孔中，观察平板透明圈的大小。在检测过程中以缓冲液系统作为阴性对照、缓冲液酶液系统作为阳性对照。

1.2.6 DNS比色法

在酶反应体系中加入待测液，测定剩余酶活，以灭活后的体系和原酶反应体系作为对照，根据酶活是否下降以及下降的程度来判定抑制性。几丁质酶抑制物的抑制活性可以用抑制率来计算：

测试组1：500μL胶体几丁质加入500μL酶液和1500μL pH 6.0磷酸缓冲液，在50℃进行酶促反应1 h后进行测定。

对照组1：500μL胶体几丁质加入500μL酶液和1500μL pH6.0磷酸缓冲液，加样后立即沸水浴10min灭酶活，和其他组一起测定。

测试组2：500μL胶体几丁质加入500μL酶液、1000μL培养液和500μL pH6.0磷酸缓冲液，在50℃进行酶促反应1h后进行测定。

对照组2：500μL胶体几丁质加入500μL酶液、1000μL培养液和500μL pH6.0磷酸缓冲液，加样后立即沸水浴10min灭酶活，和其他组一起测定。

测试组1与对照组1的吸光度差值为ΔA1，测试组2与对照组2的吸光度差值为ΔA2，测定后按公式(1)计算抑制率。

1.2.7 活性物质的初步筛选

将发酵液抽滤取上清，加入3倍体积无水乙醇进行醇沉处理，4℃冰箱过夜。醇沉过夜的发酵液在6000r/min离心20min，沉淀用热蒸馏水溶解，加入Sevag试剂除蛋白(加入比例为发酵液与Sevag试剂体积比4:1；Sevag试剂配比为氯仿与正丁醇体积比4:1)。

提取液浓缩后加样到已平衡的Sephadex G-100凝胶过滤柱(2.0cm×80cm)，用二蒸水洗脱，流速20mL/h，每5mL收集一管，采用DNS比色法及HPLC法检测确定活性流分区域。色谱条件如下：GPC分离柱(7.8mm×300mm)，2414型示差折光检测器；流动相为纯水，流速0.6mL/min；检测器温度40℃，柱温度60℃。

1.2.8 活性物质的初步鉴定

收集活性流分经冷冻干燥机冻成粉末。将此纯品送分析测试中心进行红外检测、元素分析和质谱检测。

红外条件：KBr压片，常温(25℃)下测试。质谱条件：EI 离子源，离子源温度230℃；电离能量70eV；发射电流34.6μA；溶剂延迟3min；扫描质量范围：20～500u，扫描间隔0.2s。

元素分析条件：EURO EA 3000元素分析仪上测得。

1.2.9 活性物质的理化性质

将活性物质粉末分别用乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、DMSO、氘代DMSO、氘水等试剂溶解，验证活性成分的溶解性。

2 结果与分析

2.1 氨基葡萄糖标准曲线

在一定范围内，还原糖N-乙酰-D-氨基葡萄糖的量与DNS液显色后的吸光度呈正线性关系，在500nm波长处测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖的吸光度，利用吸光度可测知样品的含糖量，得到酶活力。

式中：k为N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线的斜率，1.1356；n为酶液稀释倍数；M为N-乙酰-D-氨基葡萄糖相对分子质量，221.2；t为酶反应时间/h。

由酶活力与A500nm值的转化公式可得，从棉铃虫蛹提取到的粗酶液的酶活力为14.65U/mL。

2.2 活性菌株的筛选

图1 平板透明圈示意图Fig.1 Schematic diagram of transparent plate for screening strains

表1 活性菌株筛选的相关实验参数Table 1 Results of screening for anti-chitinase strains

本研究利用平板透明圈法和DNS比色法从500多株菌中筛选出具有几丁质酶抑制作用的活性菌共29株菌株(其中细菌11株，放线菌18株)。

几丁质酶抑制化合物筛选平板含有胶体几丁质和琼脂。在平板上打孔加入酶液，几丁质酶能分解平板中的胶体几丁质而产生透明圈。用相同量的酶液与检测液混合时、透明圈变小表明酶的活性受到抑制、透明圈越小表明受抑制的程度越高。由图1可知，平板透明圈法筛选几丁质酶抑制物快捷、直观，所以在粗筛的过程中采用此模型。表1是各活性菌株初筛、复筛的相关数据。

2.3 A0901#放线菌活性物质的分离纯化

采用活性追踪的方法对A0901#菌株发酵产物进行分离纯化。经乙酸乙酯、醇沉分别处理后，检测得出发酵液在乙酸乙酯萃余相和醇沉处理相有活性(表2)，经Sevag试剂除蛋白和Sephadex G-100凝胶过滤层析后的流分经高效液相色谱检测得到一个保留时间为15min左右的峰(图2)，DNS活性检测验证证明此流分有活性，根据保留时间表明分子质量不是很大；DNS检测其抑制率为54.2%，有抑制性(表3)。

表2 DNS法测得A0901#菌各相活性Table 2 Inhibition rates of fractions of fermentation broth of strain A0901# separated by different methods on chitinase

图2 活性物质流分HPLC图Fig.2 HPLC separation of chitinase inhibitor in the alcohol precipitate of fermentation both of strain A0901#

表3 DNS法测活性物质流分A500nm值和抑制率Table 3 Inhibition rate of the active peak obtained from HPLC separation on chitinase

2.4 活性物质的初步解析

IR谱图的3300cm-1处有吸收，表明有羟基存在(图3)；MS谱图显示活性物质的相对分子质量为279(图4)；元素分析结果显示C、H比为1:2(表4)，结合上述数据可以确定活性物质的分子式为C9H18O10。

图3 活性物质红外谱图Fig.3 IR spectrum of the separated chitinase inhibitor

表4 活性物质的元素分析结果Table 4 Element composition of the separated chitinase inhibitor

2.5 活性物质的理化性质

用等量的丙酮、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、氘水、DMSO和氘代DMSO进行溶解实验，仅仅只有DMSO和氘代DMSO能溶解此活性物质；用氯仿溶解时，活性物质在溶液中形成絮状沉淀，在甲醇、丙酮溶液中则完全不溶。

3 讨 论

研究几丁质酶抑制剂，不仅对于深入研究几丁质酶的结构与功能，为研究几丁质酶的催化机制提供理论基础也可为研发新型的杀菌剂、杀虫剂、抗感染等化疗药物提供新的导向，对农业、医药的发展将具有重要意义而且还可以在此基础上人工设计其类似物作为几丁质酶抑制剂，也可以为深入阐释几丁质酶抑制剂的抑制机制奠定基础。

图4 活性物质质谱图Fig.4 Mass pectrum of the separated chitinase inhibitor

目前，几丁质酶抑制剂活性的检测方法有：利用同位素标记的放射性测定法；与显色底物作用的比色测定方法等[17]。其中利用同位素测定的放射性测定法过程复杂，因而不适用于大规模的药物筛选。基于与显色底物作用的比色法，反应过程简单，操作方便，适用于大规模药物筛选模型应用。

本筛选模型中酶为从棉铃虫蛹中提取的粗酶，以此为底物筛选出的几丁质酶抑制剂更符合生产生活中的实际应用。本实验初筛的检测方法为平板透明圈法，方法操作简便、灵敏，为大规模筛选几丁质酶抑制剂提供了保障。复筛采用DNS比色法，操作简便、稳定，排除初筛时有可能造成的误差及有颜色发酵液造成的干扰，计算时将本底扣除。实验筛选出具有较强抑制几丁质酶活性的微生物菌株29株，该酶抑制剂能有效抑制棉铃虫蛹几丁质酶活性。

目前比较有效的几丁质酶抑制剂主要还是allosamidin和环五肽 (argifin和argadin)等天然化合物，因为它们都是属于在纳摩尔浓度下就能有效发挥抑制作用的酶抑制剂。阿洛菌素是由2分子N-2-乙酰基-2-D-2-氨基阿洛糖和1分子氨基环戊醇衍生物构成的拟三糖化合物，在纳摩尔水平上能有效抑制属于糖苷水解酶第18家族的几丁质酶，但对属于糖苷水解酶第19家族的几丁质酶没有抑制作用。精氨芬和阿尔加定是水溶性的环五肽。精氨芬的肽基化精氨酸残基在与18家族几丁质酶的结合过程中发挥重要作用，它能在纳摩尔-毫摩尔水平上对18家族几丁质酶产生抑制作用[10]。

本研究在建立简便、快速几丁质酶抑制化合物的检测方法(平板透明圈法和DNS比色法) 的基础上，从土壤中筛选到放线菌A0901#。该菌株的次级代谢产物中含有几丁质酶抑制化合物。在对该几丁质酶抑制化合物性质初步探索的过程中发现该活性物质是水溶性化合物，乙醇醇沉可将其分离，不溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、氘水等有机试剂，红外检测显示是多羟基的化合物，质谱和元素分析结果推断出此活性物质的分子式。从以上的研究结果可以初步推断放线菌A0901#次级代谢产物中的几丁质酶抑制化合物是糖类物质。关于该物质的结构分析和其相关理化性质工作尚在进行中。这些都为进一步筛选出有抑制作用的化合物，从而把它开发成一种实用性较强的生物农药，用于防治真菌、线虫及昆虫性病害提供参考。

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Screening and Purification of Insect Chitinase Inhibitor of Microbial Origin

ZHANG Hong-bin，LIU Ming-yan，TIAN Yu-jing，HU Xue-qin
(School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Helicoverpa armigerachitinase was used as the target to screen strains able to inhibit chitinase by transparent ring plate screening method and DNS colorimetric screening method. A total of 29 strains including strain A0901#were selected out of 500 ones. For separation and purification, the fermentation products of strain A0901#were subjected to alcohol precipitation,protein removal by Sevag s method and gel filtration chromatographic fractionation, and a pure bioactive material was obtained.This bioactive material exhibited a single HPLC peak with a retention time of 15 min. Its inhibition rate on chitinase was evaluated by DNS colorimetric method to be 54.2%. Moreover, its formula was C9H18O10 according to the IR and mass and element analyses, and its nature also proved a multiple hydroxyl compound.

chitinase；inhibitor；screening；isolation

Q939.97

A

1002-6630(2010)23-0271-05

2010-09-14

安徽省国际科技合作项目(08080703017)；国家大学生创新性实验计划项目 (091035945)

张洪斌(1970—)，男，副教授，博士，研究方向生物化工与酶工程。E-mail：zhb5678@163.com