蛹虫草菌丝体发酵培养过程中氨基酸添加技术研究

贲松彬，李惠娇，黄子琪，桑育黎，孟程程，侯 潇，牟 藤，陈长兰,*

(1.辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁大学药学院，辽宁 沈阳 110036)

蛹虫草菌丝体发酵培养过程中氨基酸添加技术研究

贲松彬1，李惠娇2，黄子琪1，桑育黎2，孟程程1，侯 潇1，牟 藤1，陈长兰2,*

(1.辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁大学药学院，辽宁 沈阳 110036)

组氨酸、精氨酸、赖氨酸是对蛹虫草生长影响较大的3种碱性氨基酸，本实验研究在蛹虫草液体发酵过程中添加上述氨基酸的不同条件对蛹虫草菌丝体生物量和其中主要抗癌功能成分虫草素的影响。首先进行添加氨基酸种类、氨基酸的添加量、初始pH值、培养温度对蛹虫草菌丝体生物量和虫草素含量的单因素试验，在此基础上进行四因素三水平的正交试验。结果表明：对蛹虫草菌丝体生物量影响从大到小的顺序依次是：氨基酸种类＞培养温度＞初始pH值＞氨基酸添加量。增加蛹虫草菌丝体生物量的最佳培养条件为：添加氨基酸种类为精氨酸，培养温度为26℃，培养初始pH值为6，100mL PDA发酵培养液添加精氨酸0.3g。对蛹虫草菌丝体中虫草素含量影响从大到小的顺序依次是：氨基酸种类＞初始pH值＞培养温度＞氨基酸添加量。增加菌丝体中虫草素含量的最佳培养条件是添加氨基酸种类为精氨酸，培养温度为24℃，100mL PDA发酵培养液添加0.3g，培养的初始pH值为6。

蛹虫草；虫草素；氨基酸；添加工艺

蛹虫草(Cordyceps militarisL. Link.)又名北虫草、蛹草、北冬虫夏草，属子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属[1]，其主要药用成分有虫草多糖类[2-6]、氨基酸类、糖醇和甾醇类[7-11]、虫草素(cordycepin，化学结构为3＇-脱氧腺苷(3＇-deoxyadenosine))等核苷类化合物[12-14]、肽类、维生素类[8]以及无机元素及其他类物质。虫草及虫草菌丝体制剂能明显提高机体的免疫功能[15]，具有抗肿瘤作用[16-17]、镇静作用[18]、抗放疗作用[19]，以及对心脑血管、肾病的治疗作用和延缓衰老的作用[20-24]。

氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。它在体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。Masuda等[25]发现在液体发酵培养基内添加甘氨酸，L-天门冬氨酸以及L-谷氨酰胺可以提高蛹虫草的产量，最大可以达到2.5g/L。本实验通过在蛹虫草液体培养液中添加组氨酸、精氨酸和赖氨酸3种碱性氨基酸，探讨添加碱性氨基酸对于蛹虫草菌丝体生长的影响，以及对蛹虫草中主要抗癌成分虫草素含量的影响，并通过多因素多水平的正交试验对最佳添加技术进行研究，以便达到提高蛹虫草菌丝体培养效率的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

虫草素标准品 美国Sigma公司；乙腈和甲醇(色谱纯) 汉邦科技有限公司进口分装；氨水、NaOH、盐酸等均为分析纯。

DHG-9146电热恒温鼓风干燥箱、DNP-9082型电热恒温培养箱 上海精宏实验制备有限公司；PB-10 pH计北京赛多利斯仪器系统有限公司；LabAlliance 3500G高效液相色谱仪 美国SSI公司；SW-GJ-2FD 洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司；681 磁力加热搅拌器 上海南汇电讯器材厂；高速冷冻离心机 美国科峻仪器公司；HZS-H型水浴振荡器 哈尔滨东联电子开发有限公司；RE5299旋转蒸发仪 上海亚荣仪器有限公司。

1.2 菌种与培养基

蛹虫草菌L4由本实验室自行分离(子实体来自沈阳市蛹虫草培养基地)。

斜面培养基：PDA固体培养基；种子培养基：蔗糖5.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%；PDA发酵培养基：土豆20.0%、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、琼脂2.0%、VB11mg/L。

1.3 蛹虫草液体培养方法

1.3.1 发酵种子制备

先将制备好的斜面培养基上的母种用接种铲取一块约2 0 m m2大小的菌苔接入种子培养基(装样量为100mL/300mL三角瓶)中，在26℃、130r/min恒温振荡器上发酵3d，形成微小的菌球。

1.3.2 发酵培养

采用摇瓶培养，在300mL三角瓶中装入100mL PDA发酵液，121℃、20min灭菌后接入培养3d的种子发酵液5mL，培养温度26℃，摇床转速130r/min，培养时间为5 d。

1.4 添加氨基酸培养条件的单因素试验

1.4.1 添加氨基酸种类对蛹虫草生物量和虫草素产量的影响

氨基酸作为有机氮源，对蛹虫草的生长会起到一定的作用。为考察添加不同氨基酸对蛹虫草生物量及虫草素产量的影响，在100mL发酵培养基中分别加入组氨酸、精氨酸、赖氨酸各0.2g[5]，并作空白对照。在26℃，pH值自然，130r/min的条件下，培养5d，测定其生物量及虫草素产量。

1.4.2 氨基酸添加量对蛹虫草生物量和虫草素产量的影响

添加精氨酸使蛹虫草生物量及虫草素产量提高最显著，为考察精氨酸促进蛹虫草生长和提高虫草素产量的最佳用量，向发酵培养基中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g的精氨酸，在26℃，pH值自然，130r/min的条件下，培养5d，测定其生物量及虫草素产量。

1.4.3 初始pH值对蛹虫草生物量和虫草素含量的影响

蛹虫草深层液体培养要求适宜的pH值。为考察不同初始pH值对蛹虫草生物量及虫草素产量的影响，将发酵培养基初始pH值用2mol/L的HCl和2mol/L的NaCl分别调至2、3、4、5、6、7、8、9，添加精氨酸的量为0.2g，在26℃、130r/min的条件下，培养5d，测定其生物量及虫草素产量。

1.4.4 温度对蛹虫草生物量和虫草素产量的影响

温度会影响细胞内酶活性和发酵液的溶氧量。很多虫生真菌的最适生长温度都在20～30℃之间。为考察不同温度对蛹虫草生物量及虫草素产量的影响，将培养温度分别定为22、24、26、28、30℃，在初始pH7.0，130r/min的条件下，培养5d，测定其生物量及虫草素产量。

1.5 添加氨基酸培养条件的四因素三水平正交试验

在根据单因素试验大致确定最佳实验条件后，以氨基酸种类、氨基酸浓度、培养温度、培养酸碱度做四因素三水平的正交试验。

1.6 菌丝体生物量的测定

采用干质量法。发酵结束后，将发酵液抽滤，分离得到菌丝体用蒸馏水冲洗2次后放入60℃烘箱烘12h至质量恒定，称量记录干菌质量，用干菌丝得率η(即蛹虫草生物量)来表示。

式中：η为干菌丝得率/(g/L)；m为干菌丝质量/g；V为发酵液体积/L。1.7 虫草素产量测定

1.7.1 虫草素标准溶液的配制

准确称取虫草素标准品5mg，超纯水溶解定容至10mL，配制成500μg/mL的标准储备液。再将其稀释成10、20、40、60、80、100μg/mL虫草素标准液，待测定。

1.7.2 虫草素产量的HPLC测定

HPLC测定：所用高效液相色谱仪为美国SSI公司的LabAlliance 3500G型高效液相色谱仪，色谱柱采用Waters Nova-pak C18(4.6mm×250mm)；检测器为CS420x HARDWARE型；检测波长为260nm；柱温35℃；流动相：乙腈、超净水(体积分数=15:85)；流速为1mL/min；进样量为20μL。

1.7.3 虫草素提取

将干菌丝研细粉进行微波提取，向150mL三角瓶中加入0.25g样品，再加25mL生理盐水(容量瓶定容)，微波中火(500W)处理2min，反复进行两次，将提取液12000r/min离心6min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤器压滤，定容到25 mL，待测。

2 结果与分析

2.1 添加氨基酸培养条件的单因素试验结果

2.1.1 添加氨基酸种类对菌丝体生物量和虫草素产量的影响

图1 氨基酸种类对菌丝体生物量和虫草素产量的影响Fig. 1 Effect of amino acid type on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation processand that of cordycepin

氨基酸作为蛋白质的组成成分，参与蛋白质的代谢，可以起到促进生长的作用。由图1可知，添加氨基酸的培养液中菌丝体生物量及虫草素产量明显提高，其中添加精氨酸的培养液中菌丝体生物量及虫草素产量提高最大，其菌丝体生物量和虫草素产量由空白对照(不添加处理)的7.19g/L(培养液)和2.01mg/g(菌丝体干质量)提高到14.82g/L和5.84mg/g。其次是组氨酸和赖氨酸，添加组氨酸的处理组菌丝体生物量和虫草素产量提高到11.24g/L和5.67mg/g，添加赖氨酸的处理菌丝体生物量和虫草素产量提高到13.52g/L和4.23mg/g。

2.1.2 氨基酸添加量对菌丝体生物量和虫草素产量的影响

图2 精氮酸添加量对菌丝体生物量和虫草素产量的影响Fig.2 Effect of amino acid addition amount on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由图2可知，精氨酸的添加量对菌丝体生物量及虫草素的产量都有很大影响。添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g的精氨酸后蛹虫草的菌丝体生物量分别从不添加处理的7.19g/L上升到15.80、14.57、15.40、14.97、13.06、8.97g/L，菌丝体中虫草素含量从不添加处理的2.15mg/g上升到4.13、5.87、3.82、3.82、3.92、2.73mg/g。添加0.1g的精氨酸适于虫草素菌丝体生长。添加0.2g的精氨酸适于生产虫草素。随着精氨酸添加量的进一步提高，菌丝体的生物量与虫草素的产量并没有随之提高，反而开始下降。

2.1.3 初始pH值对菌丝体生物量和虫草素产量的影响

图3 初始pH值对菌丝体生物量及虫草素产量的影响Fig.3 Effect of initial pH on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由图3可知，由于培养液中的pH值会影响到细胞内pH值的变化，进而影响细胞内酶的活性，也影响到蛹虫草菌对一些微量元素的利用，所以培养液的初始pH值对菌丝体生物量及虫草素产量均有很大影响。培养液初始p H值为3、4、5、6、7、8、9时培养液中的菌丝体生物量分别为3.41、9.03、12.33、13.27、14.02、10.32、5.50g/L，菌丝体中虫草素含量分别为1.41、3.96、4.35、4.02、4.77、3.41、2.01mg/g。适于蛹虫草细胞生长和生产虫草素的最佳初始pH值同为7.0。

2.1.4 培养温度对菌丝体生物量和虫草素产量的影响

图4 培养温度对菌丝体生物量和虫草素产量的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由图4可知，培养温度对菌丝体生物量及虫草素产量有很大影响。培养温度为22、24、26、28、30℃时培养液中的菌丝体生物量分别为7.44、12.00、14.90、13.21、6.35g/L，菌丝体中虫草素含量分别为2.69、3.88、4.15、4.77、3.94mg/g。适于蛹虫草菌丝体生长的最佳温度为26℃，而产虫草素的最佳温度为28℃。

2.2 添加氨基酸培养条件的正交试验结果

根据单因素试验结果，拟定添加氨基酸影响蛹虫草液体培养生产虫草素的4个因素即A(添加氨基酸种类)、B(氨基酸添加量)、C(初始pH值)、D(培养温度)为优选因素，每个因素选3个水平进行正交试验，正交试验条件见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验设计的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

从菌丝体生长量的偏差平方和和F比值可以看出(表2)，影响蛹虫草生长量的因素由大到小依次为：添加氨基酸种类＞培养温度＞初始pH值＞添加氨基酸量；从菌丝体生物量的均值可看出，最佳培养条件的组合为A2B3C1D2，即添加氨基酸种类为精氨酸，添加量为0.3g，培养的初始pH值为6，培养温度为26℃。

从虫草素产量的偏差平方和和F比值可以看出(表2)，影响蛹虫草菌丝体中虫草素含量的因素由大到小依次为：添加氨基酸种类＞初始pH值＞培养温度＞添加氨基酸量；从虫草素产量可以看出，最佳培养条件的组合为A2B3C1D1，即添加氨基酸种类为精氨酸，添加量为0.3 g，培养的初始p H值为6，培养温度为24℃。

表2 添加氨基酸培养蛹虫草的四因素三水平正交试验结果分析Table 2 Result analysis of orthogonal experiments

2.3 正交试验结果验证

根据以上添加氨基酸对菌体生物量和虫草素生产最优培养条件，即对菌体生物量的影响的最优组合为A2(精氨酸)、B2(0.3g)、C1(pH6)、D2(培养温度为 26℃)，对菌丝体中虫草素产量影响的最优组合为A2(精氨酸)、B3(0.3g)、C1(pH6)、D1(培养温度为24℃)。验证实验结果见表3。

表3 正交试验所确定的最佳条件的验证实验Table 3 Validation of orthogonal experimental results

由表3可知，最优的实验组合与对照组相比均能提高蛹虫草的菌丝体生物量以及提高其生产虫草素的能力。处理组合的菌丝体生物量和虫草素含量分别达到对照的237.5%和245.1%，差异极显著。

3 讨 论

氨基酸作为蛋白质的组成成分，参与蛋白质的代谢，可以起到促进生长的作用。从本实验结果，添加氨基酸，尤其是精氨酸后，蛹虫草生物量及虫草素产量明显提高，但当氨基酸产量达到一定值后继续增加时，菌丝体生物量及虫草素产量则有下降趋势，这可能是由于细胞的生长和代谢需要一定的C/N比，而氨基酸作为有机氮源，影响了这一比值，此问题需进一步深入研究。

本实验仅是添加技术的初步实验，在本实验中仅研究了氨基酸种类、氨基酸添加量、初始pH值和培养温度这4个因素，还有很多其他因素如培养基成分、装样量、通气量等因素都有可能对发酵过程及结果产生重要影响。以前实验中对添加硒对蛹虫草菌丝体生长和虫草素含量的影响进行了研究[26-27]，在以后的实验中，还要进行更多的实验找出更加优化的培养条件。

本研究仅对影响蛹虫草菌丝体发酵培养过程中生物量和虫草素产量最为显著的3种碱性氨基酸进行系统研究。在后续研究还将对包含其他17种氨基酸的所有氨基酸以及它们之间的相互作用进行研究分析。

蛹虫草的活性有效成分除虫草素外，还包括虫草多糖和虫草酸等，二者也具有很大的药用价值和保健功效。本实验只针对添加氨基酸后对虫草素含量的影响进行了考察，在以后的实验中将对虫草多糖和虫草酸进行考察，更全面系统的掌握添加氨基酸对蛹虫草有效成分的影响，找到最佳培养条件。

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Amino Acid Addition Technology during Mycelium Fermentation ofCordyceps militaris

BEN Song-bin1，LI Hui-jiao2，HUANG Zi-qi1，SANG Yu-li2，MENG Cheng-cheng1，HOU Xiao1，MU Teng1，CHEN Chang-lan2,*
(1. School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. School of Pharmaceutical Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Histidine, arginine and lysine are alkaline amino acids that have an important effect on the growth ofCordyceps militaris. In this study, the effects of amino acid addition under various conditions on the growth of mycelium and the production of cordycepin as an anti-cancer functional ingredient during the fermentation process was investigated. Single factor experiments confirmed that the order of factors to affect the growth of mycelium during fermentation process from strong to weak was amino acid type, fermentation temperature, initial pH and amino acid amount. The optimal fermentation conditions for the growth of mycelium were explored by orthogonal experiments to be lysine as the selected amino acid, fermentation temperature of 26 ℃,initial pH of 6 and lysine amount of 0.3 g in 100 mL of medium. Similarly, single factor experiments confirmed that the order of factors to affect the production of cordycepin during fermentation process from strong to weak was amino acid type, initial pH,fermentation temperature and amino acid amount. The optimal fermentation conditions for the production of cordycepin were achieved by orthogonal experiments to be arginine as the selected amino acid, initial pH of 6, fermentation temperature of 24 ℃and arginine amount of 0.3 g in 100 mL of medium.

Cordyceps militaris；cordycepin；amino acid；addition technology

S567.35；TQ266.1

A

1002-6630(2010)23-0233-05

2010-06-30

辽宁省教育厅重点实验室项目(2009S046)；国家自然科学基金项目(30671176)；辽宁大学校级三期“211工程”项目；沈阳市人才资源开发专项(2008040403035)

贲松彬(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为生物化学。E-mail：bensongbin007@163.com

*通信作者：陈长兰(1963—)，男，教授，博士，研究方向为遗传学。E-mail：chenchanglanbio@yahoo.com.cn