一株苯乙烯生物降解菌的分离、鉴定及其特性研究

门 娟，张朝正，李 舫，孔大为

（1.天津市塘沽区环境保护监测站，天津 300450；2.天津市天人和环保技术研发中心，天津 300450；3.天津科技大学 生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津300457）

苯乙烯为无色透明油状液体，易燃，有毒，难溶于水，能溶于醇类及醚类，广泛用于塑料、合成橡胶、树脂等生产中，是一种有重要价值的化合物．在苯乙烯的生产、使用、运输、贮藏过程中会有较大量苯乙烯进入大气和水体，造成大气和水的污染，同时对人体健康有害．全球研究者自20世纪70年代以来己从各地土壤、废水中分离到有苯乙烯降解能力的多种微生物[1-2]，取得了一定的成果，其中Pseudomonas fluorescens ST[3]，Actinomycetes[4]，Rhodococcus pyridinovorans[5]，Brevibacillus sp.[6]，Pseudomonas sp.SR-5[7]，Pseudomonas putida SN1[8]等均研究报道效果明显．也有研究者采用其它方法进行苯乙烯的降解研究[9-10]．

本文采用唯一碳源筛选的方法，从苯乙烯生产厂家处理污水的活性污泥中分离出一株高效苯乙烯降解菌，对其进行了分类鉴定，研究了该菌株在不同条件下的降解能力，考核了在实际污水中的降解效果．通过研究其特性，有助于了解其降解机理，以便改进含苯乙烯的工业废水的处理，并利用微生物的净化能力，在一定程度上解决环境污染问题．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 活性污泥

天津塘沽苯乙烯生产厂家处理污水的活性污泥，由塘沽区环保局环境保护监测站采样．

1.1.2 主要试剂

酵母粉，蛋白胨，牛肉膏，NaCl，葡萄糖，琼脂粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，硫酸铵，硫酸镁，所有试剂均为生化试剂或者分析纯试剂．

1.1.3 主要仪器

自动微生物鉴定系统，Biolog公司；PCR仪，电泳仪，电击仪，核酸蛋白分析仪均为Bio-rad公司产品；气相色谱，Agilent6890N．

1.1.4 培养基

唯一碳源培养基（液体）：硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钠1.3g/L，硫酸镁0.2g/L，pH7.0，121℃灭菌20 min．接种前加入配制好的一定量的苯乙烯琼脂块．

唯一碳源培养基（固体）：硫酸铵2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，磷酸氢二钠1.3 g/L，硫酸镁0.2 g/L，琼脂粉20 g/L，pH7.0，121℃灭菌20 min，倒平皿前加入1%体积的苯乙烯．

苯乙烯琼脂块：琼脂20 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min，待冷却到50~60℃时加入1%体积的苯乙烯，混匀后倒平皿（稍厚）．用刀切成小块备用，放置时间不要超过1 h．

按照党中央、国务院和云南省委、省政府关于生态文明建设和决战脱贫攻坚的决策部署，紧密联系林业现代化建设和改革发展实际，围绕增绿、增质、增效和提供更多优质生态产品以满足人民日益增长的优美生态环境需要的目标，云南省对林业供给侧结构性改革和配套措施的探索，长期走在国内前列。

1.2 实验方法

1.2.1 苯乙烯降解菌株的分离

将一定量的活性污泥放入100mL无菌水中，轻微震荡，然后放于30℃培养箱中活化30min，震荡使菌体尽可能多的从污泥上洗脱下来．将一定量的从污泥上洗脱下来的菌液接种到唯一碳源培养基（液体）中，30℃培养2 d；培养液涂布在唯一碳源培养基（固体）上，30℃培养，挑取较大的单菌落进行镜检，同时接种到唯一碳源培养基（液体）中30℃培养2d，然后再涂布在唯一碳源培养基（固体）上．经反复筛选，最后筛选出一株以苯乙烯为唯一碳源生长且具有高效降解能力的菌株，保存在营养肉汤培养基中．

1.2.2 菌体生物量与苯乙烯含量的测定

菌体生物量用核酸蛋白分析仪测定，把取得的发酵液6000r/min离心，菌体用无菌水洗涤3次，用相同体积的无菌水稀释，然后用核酸蛋白分析仪检测菌悬液在600 nm下的吸光度值，表征菌体的生物量，测定时以水作为空白．

采用气相色谱仪Agilent 6890N（带顶空自动进样器）对苯乙烯的浓度进行检测．

顶空自动进样器的条件：阀温60℃，平衡时间20 min，进样量1L，顶空瓶（20 mL）中样品液体积10 mL．

1.3 菌株的鉴定

菌株的鉴定采取文献 [11]上的方法．

2 结果与讨论

2.1 苯乙烯降解菌株的分离

把活性污泥洗脱液接种到唯一碳源液体培养基中30℃培养2d，然后把培养液在固体培养基上涂布，再把固体平板上的单菌落接种到液体培养基中，通过反复4次接种涂布，最后分离得到一株以苯乙烯作为唯一碳源生长的菌株，该菌株对苯乙烯有很强的降解能力，命名为MJ001．

2.2 菌株的形态及生化特性

菌株MJ001在固体培养基上，菌株形态见图1．个体形态为稍弯、两端钝圆的杆菌，大小0.5~0.7，有鞭毛，能运动．革兰氏染色阴性，着色不明显，兼性厌氧，最适生长温度30℃，最适pH6.7~7.4，三糖铁实验K/K，氧化酶反应阳性．

图1 菌株MJ001的形态Fig.1 The configuration of MJ001

2.3 菌株MJ001的16SrDNA序列分析

细菌的16SrDNA结构具有保守性，能反应出生物物种的亲缘关系，为生物系统的进化提供线索，也是生物物种的特征核苷酸序列．目前，16S rDNA序列分析已经成为细菌系统分类研究中最有力也是最常用的工具．

以菌株的总DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物进行扩增，得到长度为1436bp的DNA，测定其基因序列，将测序结果输入Gen Bank，用Blast软件与已知的16SrDNA序列进行比对，根据比对结果知道该菌株采用16SrDNA序列分析的方法鉴定为Pseudomonas sp.．菌株的16S rDNA序列见图2．

图2 MJ001的16S rDNA序列Fig.2 The16S rDNA sequence of MJ001

2.4 菌株的Biolog鉴定

根据MJ001的生理生化实验结果（革兰氏染色阴性，三糖铁实验K/K，氧化酶反应阳性）确定MJ001的培养类型为GN-ENT（革兰氏阴性肠道菌），把MJ001接种到BUG+B培养基上，30℃培养16h后用棉签把菌落沾起，分散到GN/GP-IF（细菌专用接种液）中，制备成均一的菌悬液，调整浊度到52%±3%（透光度），然后接种到 GN（革兰氏阴性菌）鉴定板上，接种量150L，30℃培养．对MJ001在鉴定板上培养4~6 h和16~24 h的结果读取了数据，鉴定结果显示与Pseudomonas aeruginosa最接近．

图3给出了Biolog鉴定16~24 h时，MJ001对鉴定板上不同碳源的代谢情况．Biolog GN鉴定板上A1孔是水，其它95孔中为不同种类的碳源，种类包括有机酸、氨基酸和糖类等．图3显示在16~24 h时，MJ001对96微孔板中的59种碳源利用明显，20种利用微弱，而对其中的16种碳源根本不利用，这和伯杰氏细菌鉴定手册上的报道十分接近．

2.5 不同苯乙烯浓度下菌体生长情况及菌株MJ001的降解效果

把菌株接种在含有不同浓度苯乙烯的唯一碳源培养基中培养，30℃培养，间隔2h取样，用核酸蛋白分析仪检测菌悬液在600nm下的吸光度值，比较不同苯乙烯浓度对菌株生长的影响．从接种6h开始，间隔4 h取样，检测苯乙烯的降解情况．图4是不同苯乙烯浓度对菌体生长的影响图，图5是不同苯乙烯浓度对菌株MJ001的苯乙烯降解率的影响．

从图4可以看出MJ001在苯乙烯浓度1~7 mg/L时均能生长，生长趋势一致．与5~7 mg/L苯乙烯浓度相比，在1~4 mg/L时，MJ001的延迟期较短，到稳定期生物量较大．可见MJ001在苯乙烯浓度1~7 mg/L时均能生长良好，随着苯乙烯浓度的增加菌体浓度增加，在4 mg/L时，菌体浓度最大，大于4 mg/L时，由于苯乙烯的毒性，菌体浓度开始下降，但是稳定期时间较长，这可能由于苯乙烯浓度大，能持续提供营养．

图5可以看出在不同的苯乙烯浓度下菌株MJ001对苯乙烯的降解情况略有不同．降解30h后，苯乙烯浓度在1~4 mg/L时，菌株MJ001对苯乙烯的降解率随着苯乙烯浓度的增加而增加，苯乙烯浓度在4 mg/L时达到96.3%，但总体来看降解率在93.2%~96.3%之间，差别不大．而当苯乙烯浓度增加到5 mg/L后，随着苯乙烯浓度的增加，降解率开始下降，苯乙烯浓度7 mg/L时降解率降到82.7%，这与此时的菌体浓度低的结果是一致的，原因也是一致的．

2.6 温度对菌株MJ001降解效果的影响

考查在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5个温度下菌株MJ001对苯乙烯的降解情况，苯乙烯浓度4 mg/L．培养24 h后，检测苯乙烯降解情况，不同温度下的降解效果见图6．温度在30℃时对苯乙烯的降解率最大，可达95.3%，温度过高和过低都影响对苯乙烯的降解，这与30℃为该菌株的最适生长温度有关．

2.7 溶氧对菌株MJ001降解效果的影响

研究不同摇床转速对苯乙烯降解效果的影响，选取8个不同的转速，其它条件相同，考核溶解氧对MJ001的降解效果的影响，结果见图7．由图7可见不同的摇床转速对菌株MJ001的降解效果几乎没有影响，这与菌株兼性厌氧的特性一致．

图3 MJ001的代谢指纹特征图Fig.3 The metabolic characteristics of MJ001

图4 MJ001在不同苯乙烯浓度下的生长曲线Fig.4 The growth curve of MJ001 under different styrene concentration

图5 MJ001对不同浓度苯乙烯的降解率Fig.5 The degradation rate of styrene under different concentration

图6 不同温度下MJ001对苯乙烯的降解率Fig.6 The effect of degradation rate of styrene on temperature

2.8 菌株在废水中的降解试验

选取了5个低浓度的苯乙烯废水，研究菌株MJ001对真实废水的降解试验，发现在8h之内能降解苯乙烯总量的77.6%~88.5%，16 h之后苯乙烯降解89.6%~90.1%，24 h后各种浓度的苯乙烯溶液几乎均能得到充分降解，苯乙烯终浓度小于0.5 mg/L，降解效率达到94%~96.2%，见表1．

图7 转速对MJ001的降解效果的影响Fig.7 The effect of degradation rate to styrene on shaker speed

表1 废水中的降解实验Tab.1 The degradation of styrene in waste water

3 讨论

微生物降解苯乙烯的报道国内外均有，本研究采用唯一碳源筛选的方法从处理含苯乙烯废水的活性污泥中筛选得到一株苯乙烯降解菌，命名MJ001．采用分子生物学鉴定和Biolog快速鉴定两种方法对其进行鉴定，结果为Pseudomonas aeruginosa．研究了菌株在不同苯乙烯浓度、温度、溶氧条件下的降解效果，该菌株30℃时，在一定苯乙烯浓度下均能较好的降解苯乙烯，在实际含苯乙烯废水中对苯乙烯的降解率可达94%以上，达到排放标准．本文研究表明MJ001用于生物降解苯乙烯是可行的．

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