酶催化乳酸铵制备乳酸乙酯工艺条件的研究

王营营，姜艳军，周丽亚，高 静

（河北工业大学 化工学院，天津 300130）

0 前言

乳酸乙酯具有无毒、溶解性好、不易挥发及可生物降解等优点，可作为制药工业中制压片润滑剂和某些药品的中间体，还是常用的食品香料和生产酒类食品的重要原料，被广泛用于医药、农药和其他精细化工品领域，是极具开发价值和应用前景的“绿色溶剂”[1-2]．

制备乳酸乙酯的原料主要以乳酸和乙醇为主[3-7]，而乳酸是由乳酸铵酸化得到，用乳酸铵代替乳酸与乙醇进行酯化反应，不仅避免了乳酸对容器的腐蚀性，而且缩短了工艺流程，降低了乳酸乙酯的生产成本，为乳酸乙酯的合成开辟了新的途径[8-12]．

目前，以乳酸铵为原料合成乳酸乙酯的催化剂主要是酸催化剂．酸催化剂具有污染环境、腐蚀设备等缺点．Walkup等[12]采用CO2促进乳酸铵的分解，增加了乳酸乙酯的产率，但对反应容器的要求较高，需要较高的压力（1~200大气压），而且CO2与NH3的分离比较困难．

生物酶具有低能耗，反应条件温和，专一性强等特点．目前未见有关酶催化乳酸铵合成乳酸乙酯的报道．本文以脂肪酶为催化剂，以乳酸铵及乙醇为原料合成乳酸乙酯，为乳酸乙酯的合成提供了新的途径．

1 材料与方法

1.1 材料

Novozym435(固定化于大孔丙烯酸树脂的南极假丝酵母脂肪酶B)；CCL（非固定化南极柱状酵母脂肪酶），LipozymeTLIM（固定化于硅胶的嗜热真菌脂肪酶），以上脂肪酶均购于诺维信公司；乳酸铵，购于北化恒业精细化学品有限公司；其他试剂均为分析纯，购于天津市江天化工技术有限公司；水浴振荡器WE-2（天津欧诺仪表仪器有限公司）；气相色谱仪SP-1000（北京北分瑞丽分析仪器公司）．

1.2 方法

1.2.1 乳酸乙酯的合成

将乳酸铵和乙醇按照一定比例加入50mL的具塞锥形瓶中，再加入一定量的有机溶剂使反应物总体积为10mL，充分混合后加入一定质量的脂肪酶，在特定的温度和摇床转速下反应一定时间．

1.2.2 水解酶活的测定

参照赵天涛[4]论文中水解酶活的测定方法，将每克酶每分钟催化产生1脂肪酸定义为一个活力单位

1.2.3 酶的稳定性

反应结束后，过滤分离脂肪酶和反应液，脂肪酶经叔丁醇冲洗加入到新鲜反应底物中进行下一次的催化反应，反应条件不变．

1.2.4 乳酸乙酯的检测

采用SP-1000型气相色谱仪（PEG-20M，填充柱为2m× 3mm）测定乳酸乙酯，TCD检测器，配浙江大学N2000双通道色谱工作站，柱箱温度为100℃、进样器170℃、检测室160℃、热丝180℃，环己酮为内标物．

2 结果与讨论

2.1 酶和溶剂的选择

考察了常用的3种脂肪酶和不同有机溶剂对催化反应的影响，实验结果见表1．由表1可看出，在所选择的脂肪酶中，只有Novozym435具有催化活力，且在叔丁醇中的活性最高，其它两种酶在不同溶剂中均不具有催化能力；可能的原因是：叔丁醇维持了一定的疏水环境，增加了固定化酶的稳定性．同时，叔丁醇的加入降低了反应体系粘度，增加了反应传质速率[6,13]．故选择Novozym435作为催化剂，以叔丁醇为反应介质．

表1 不同脂肪酶在不同溶剂中对乳酸乙酯产率的影响Tab.1 Effect of different lipases on the yield of ethyl lactate in different solvents

2.2 底物配比对催化反应的影响

实验结果如图1所示．由图1可见，在反应体系中，随着乙醇添加量的增加，乳酸乙酯产率逐渐增大，铵醇物质的量之比达到1∶24时，乳酸乙酯产率达到最大．由于酯化反应为可逆反应，随着乙醇量的增加，平衡向正向移动，产率逐渐增加．但乙醇量太大，产率反而下降，这是由于过量加入乙醇导致酶失活，造成乳酸乙酯产率降低．因此，选择铵醇物质的量之比为1∶24．

2.3 反应时间对催化反应的影响

由图2可见，随着反应时间的增加，乳酸乙酯产率逐渐增大，当反应时间达到24h时，乳酸乙酯产率最大，随后变化平缓，反应已经达到平衡，因此，选择反应时间为24h．

2.4 底物浓度对催化反应的影响

由图3可以看出：随着乳酸铵浓度的增加，乳酸乙酯产率逐渐增大，当乳酸铵浓度为0.2mol/L时，乳酸乙酯产率达到28.58%，之后，随着乳酸铵浓度的增大，乳酸乙酯产率明显降低．可能的原因是：1）随着乳酸铵浓度的增大，利于反应正向进行，乳酸乙酯产率升高；2）过量的乳酸铵夺取了酶分子表面的必需水，加速了酶的失活；3）乳酸铵浓度增大的同时，乙醇浓度也不断增加，增大了乙醇对酶的失活作用，使乳酸乙酯产率下降．因此，选择乳酸铵浓度为0.2 mol/L．实验结果如图3所示．

2.5 温度对催化反应的影响

温度对反应的影响如图4所示．由图4可见，随着反应温度的增加，产率逐渐升高，当温度为60℃时，乳酸乙酯产率最大，为28.58%，原因可能是：随温度的提高，底物的粘度降低，扩散阻力减小，利于酶与底物充分接触；当温度高于60℃时，酶受热失活，使产率下降，因此，选择反应温度为60℃．

2.6 酶浓对催化反应的影响

酶浓定义为酶的质量与底物乳酸铵的物质的量之比（g/mol ammoniumlactate）．如图5所示，随着脂肪酶用量的增加，酶与底物接触几率增加，反应速度相应加快，当酶量为40g/mol时，乳酸乙酯产率达到32.38%，但进一步增加酶用量，乳酸乙酯产率变化趋于平稳，可能是由于反应过程中酶量过多造成酶的团聚，增大了传质阻力．因此，选择反应酶浓为40 g/mol．

2.7 摇床转速对催化反应的影响

由图6可看出，随着转速的增加，产率逐步提高，当转速为150 r/min时，乳酸乙酯产率达到32.38%，转速进一步提高，乳酸乙酯产率明显下降，可能是提高转速会增加固定化酶颗粒间的碰撞几率，导致反应过程中大量酶分子脱落，游离的脂肪酶在长时间的反应中更易受到环境的影响而失活，因此，选择催化反应的转速为150 r/min．

2.8 酶的稳定性

脂肪酶催化合成乳酸乙酯的主要问题是酶的制备成本比较高且易失活，实验考察了酶在叔丁醇体系中催化乳酸乙酯工艺的稳定性．由图7可以看出，脂肪酶重复使用5次，乳酸乙酯产率仍可达到22.1%．

图1 乳酸铵/乙醇摩尔比对乳酸乙酯产率的影响Fig.1 Effects of molar ratio of the substrates on the yield of ethyl lactate反应条件：乳酸铵浓度0.3 mol/L，酶浓33 g/mol，60℃，150 r/min，24 h

图2 反应时间对乳酸乙酯产率的影响Fig.2 Effect of reaction time on the yield of ethyl lactate反应条件：铵醇摩尔比1∶24，乳酸铵浓度0.3 mol/L，酶浓33 g/mol，60℃，150 r/min

图3 乳酸铵浓度对乳酸乙酯产率的影响Fig.3 Effect of the ammonium lactate concentration on the yield of ethyl lactate反应条件：铵醇摩尔比1∶24，酶浓33 g/mol，60℃，150 r/min，24 h

3 结论

本文研究了乳酸铵在固定化脂肪酶Novozym435催化下与乙醇合成乳酸乙酯的可行性，结果表明，以酶为催化剂，用乳酸铵为原料合成乳酸乙酯是可行的，通过对底物物质的量之比、反应时间、乳酸铵浓度、反应温度、酶浓和摇床转速进行优化，乳酸乙酯产率可达32.38%，固定化酶重复使用5次，乳酸乙酯产率仍保持在22%以上，虽然产率较低，但反应具有工艺线路短，温度较低，条件温和，污染少，反应安全等特点，符合环保要求，有潜在的工业应用价值．

图4 反应温度对乳酸乙酯产率的影响Fig.4 Effect of temperature on the yield of ethyl lactate反应条件：铵醇摩尔比1∶24，乳酸铵浓度0.2 mol/L，酶浓33 g/mol，150 r/min，24 h

图5酶浓对乳酸乙酯产率的影响Fig.5 Effect of enzyme concentration on the yield of ethyl lactate反应条件：铵醇摩尔比1∶24，乳酸铵浓度0.2 mol/L，60℃，150 r/min，24 h

图6 摇床转速对乳酸乙酯产率的影响Fig.6 Effect of agitation speed on the yield of ethyl lactate反应条件：铵醇摩尔比1∶24，乳酸铵浓度0.2 mol/L，酶浓40 g/mol,60℃，24 h

图7 酶的稳定性Fig.7 Operational stability of lipase反应条件：铵醇摩尔比1∶24，乳酸铵浓度0.2 mol/L，酶浓40 g/mol，60℃，24 h

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