苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测

裘雪梅，刘仁荣*，徐 玲，孟 玮，涂 顺，谢少霞

(江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013)

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测

裘雪梅，刘仁荣*，徐 玲，孟 玮，涂 顺，谢少霞

(江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013)

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物，通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原，用所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体，结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体，经鉴定为IgG2a型，并建立间接竞争ELISA检测方法，线性范围为0.5～10ng/mL，检测下限为0.1ng/mL，加标回收率为52.3%～110%，变异系数为3.2%～8.9%。

苏丹红Ⅰ；单克隆抗体；ELISA检测

Abstract：A SudanⅠanalog was synthesized by diazotization and conjugated to bovine serum albumin (BAS) or keyhole limpet hemocyanin (KLH) by active ester method and a BAS based detection antigen and a KLH based immune antigen were obtained.A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established to detect the immunogenity of the immune antigen. BALB/c mice were immunized with the immune antigen for antibody generation. For the preparation of anti-SudanⅠmonoclonal antibodies, cell fusion was used. An indirect competitive ELISA assay was developed. A linear relationship was observed over the concentration range of 0.5 to 10 ng/mL and the detection limit was 0.1 ng/mL. The average recovery rates of SudanⅠin red hot chili pepper powder spiked at 6 different levels were between 52.3% and 110% with variation coefficients varying from 3.2% to 8.9%.

Key words：Sudan Ⅰ；monoclonal antibody；ELISA detection

苏丹红Ⅰ(Sudan Ⅰ)的化学名称为1-苯基偶氮-2-萘酚，常作为工业染料，被广泛用于如溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面。动物实验表明苏丹红Ⅰ具有致癌性，可引起肝脏、膀胱和脾脏等脏器的肿瘤[1-4]。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将苏丹红归为三类致癌物，时同具有致敏性和遗传毒性[5-6]。

目前，苏丹红Ⅰ的检测方法主要是液质联用法和高效液相色谱法[7-8]，对仪器和操作人员要求较高，仪器投资大、效率低，无法满足大批量样本快速筛查的需要。免疫学分析法是建立在抗原抗体特异性反应基础上的分析方法，对样品的纯度要求较低，所需仪器设备简单，操作方便，灵敏度和特异性较高，适合于大批量样本的检测，在食品安全检测领域应用价值较高。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

红辣椒 市售；杂交瘤细胞株(6B10)由本实验室制备。

苏丹红Ⅰ、匙眼贝血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumen，BSA)、二环己基碳化二亚胺(dicylochexylcarbodiimide，DCC)、氮羟基琥珀酸(N-hydroxysuccinimide，NHS)、羰基二咪唑(1,1-carbonyldiimidazole，CDI)、ε-氨基己酸、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂和羊抗小鼠酶标二抗 Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

UV-205紫外分光光度计 日本岛津公司；微量移液器、K185紫外透射反射仪、酶标仪 芬兰Labsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 苏丹红Ⅰ结构类似物的合成与鉴定

采用重氮法合成苏丹红Ⅰ结构类似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚，化学反应原理见图1，具体步骤及鉴定方法参见文献[9]。

图1 苏丹红I结构类似物合成反应原理图Fig.1 Synthesis reaction mechanism diagram of SudanⅠanalog

1.2.2 苏丹红Ⅰ结构类似物与载体蛋白的连接

苏丹红Ⅰ1.5mg溶解于1mL四氢呋喃(THF)中，加入NHS 1.0mg和DCC 2.0mg，置室温避光振荡反应24h。每隔2h取出5μL点样，进行薄板层析，层析板置长波紫外灯下观察，对反应进行监控，展层液为丙酮:乙酸乙酯:水=(5:5:2，V/V)。待反应完全后，停止反应，10000r/min离心10min去沉淀。上清液真空抽干，得到苏丹红Ⅰ的活性酯；将苏丹红Ⅰ活性酯溶解于2mL二甲基亚砜(DMSO)中，缓慢滴入KLH溶液中(15mg溶于5mL 0.13mol/L NaHCO3)。室温振荡反应4h，得到苏丹红Ⅰ人工抗原A(同法与BSA反应得到苏丹红Ⅰ人工抗原B)。反应结束后，0.01mol/L PBS 4℃透析72h；对透析产物进行紫外扫描，根据其在280nm和486nm的光密度(OD)值、苏丹红Ⅰ和蛋白质在这两种波长下的摩尔消光系数(K)，按公式CSudanI/CBSA=(OD280×KBSA,486－OD486×KBSA,280)/(OD486×KSudanI,280－OD280×KSudanI,486)分析测定偶联产物的摩尔比，真空冻干待用。免疫BALB/c小鼠，检测其免疫原性。

1.2.3 苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备

第4次免疫间隔4周后，尾静脉注射人工抗原0.05mg/只，3d后，取脾细胞在50% PEG融合剂作用下与对数期生长的SP2/O杂交瘤细胞融合。经HAT(hypoxanthine-aminopterin-thymidine)选择培养液培养7d后，换HT(hypoxanthine-thymidine)培养基培养，取杂交瘤细胞培养上清进行阳性克隆筛选，以苏丹红Ⅰ人工抗原B为检测抗原，建立间接竞争ELISA方法，筛选分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的杂交瘤细胞。阳性细胞经有限稀释法亚克隆3次均为100%的阳性后，建立细胞系并冻存。并将杂交瘤细胞接种于提前接种降植烷的BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗。最后用Sigma单克隆抗体分型试剂盒进行分型鉴定。

1.2.4 间接竞争酶联免疫吸附分析方法的建立

棋盘滴定确定最佳的包被抗原和抗体工作质量浓度：苏丹红Ⅰ人工抗原B为检测抗原，用PBS稀释至不同的质量浓度(0.5、1、2、4、8、16μg/mL)，4℃包被过夜，3g/100mL脱脂牛奶封闭后用PBST洗涤4次，加入PBST系列稀释的抗体，取阴性血清做阴性对照，PBST做空白对照。每孔100μL，37℃ 1h后洗涤4次，加入羊抗鼠IgG：HRP酶标二抗(100μL/孔)；37℃作用1h后，洗涤4次。联苯二胺(OPD)显色，2mol/L H2SO4溶液反应，测定492nm波长吸光度(A492nm)，根据吸光度选择最佳包被抗原的质量浓度，然后选择吸光度为1.0～1.5左右的抗体的稀释倍数作为工作质量浓度。

根据确定的最佳的包被抗原和抗体工作质量浓度建立苏丹红Ⅰ间接竞争ELISA的标准曲线：检测抗原4℃包被过夜，3g/100mL脱脂牛奶封闭。加入50μL溶于体积分数为35%甲醇溶液PBS的苏丹红Ⅰ(0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000ng/mL)和抗体50μL，混匀。37℃ 1h后，PBST洗涤4次，加入酶标二抗(100μL/孔)；37℃作用1h后，洗涤4次。TMB显色，2mol/L H2SO4溶液终止反应，测定吸光度，每个浓度测定4次，取平均值。计算各质量浓度的结合率，并作标准曲线。

1.2.5 交叉反应率的测定

用30%甲醇PBS溶解不同浓度的苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、和苏丹红Ⅳ标品，取50μL进行竞争ELISA测定，计算交叉反应率。

1.2.6 加标回收率测定

红辣椒经搅碎机搅碎成辣椒粉末，称取辣椒粉1g(精确到0.01g)，向其中加入10mL含不同质量浓度苏丹红Ⅰ的体积分数70%甲醇溶液，使苏丹红Ⅰ在样品中的含量分别为4000、2000、1000、500、200、80ng/g，充分振荡5min，4000r/min离心5min，取上清液再用蒸馏水稀释2倍进行ELISA测定，计算加标回收率。

2 结果与分析

2.1 苏丹红Ⅰ结构类似物的鉴定

红外光谱及1HNMR光谱图对比分析，判断合成了苏丹红Ⅰ结构类似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚[9]。

2.2 基于苏丹红Ⅰ结构类似物的苏丹红Ⅰ人工抗原的合成

人工抗原的紫外扫描图(图2)显示，苏丹红Ⅰ结构类似物与载体蛋白BSA、KLH偶联产物的紫外扫描图谱是苏丹红I结构类似物紫外扫描图谱与载体蛋白紫外扫描图谱的叠加，表明偶联反应成功。人工抗原A、B与载体分子的物质的量比分别为232:1、13:1。

图2 苏丹红Ⅰ结构类似物、人工抗原和BSA的紫外扫描图Fig.2 UV spectra of SudanⅠanalog, artificial antigen and BSA

人工抗原免疫原性鉴定结果表明：以苏丹红Ⅰ人工抗原B为检测抗原，间接ELISA测定免疫苏丹红Ⅰ人工抗原A后的小鼠血清抗体效价为1:32000，间接竞争ELISA实验的结果显示，苏丹红Ⅰ人工抗原有效刺激机体产生了针对苏丹红Ⅰ的特异性免疫反应，抗体结合率与苏丹红Ⅰ浓度呈线性关系， 因此，该人工抗原可用于制备抗苏丹红Ⅰ的单克隆抗体。

2.3 单克隆抗体的制备

图3 苏丹红Ⅰ单克隆抗体亚型测定结果Fig.3 Subtypes of SudanⅠmonoclonal antibody

经细胞融合，筛选到一株分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的杂交瘤细胞株(6B10)，经3次亚克隆后，全部克隆为阳克隆。将上述细胞株连续培养及冻存后复苏，其分泌的抗体效价稳定不变。单克隆抗体经测定属IgG2a型，结果见图3。

2.4 间接竞争ELISA标准曲线

经棋盘滴定确定的最佳ELISA分析条件为：包被抗原质量浓度为2μg/mL，抗体工作浓度为1:32000，酶标二抗工作浓度为1:1000。根据20份空白样品测定均值加2倍标准差计算，间接竞争ELISA标准曲线的检测下限为0.1ng/mL，线性范围0.5～50ng/mL，50%抑制浓度(IC50)为 6ng/mL(图 4)。

图4 间接竞争ELISA标准曲线Fig.4 Standard curve of indirect competitive ELISA

2.5 交叉反应率的测定

表1 单克隆抗体的交叉反应率Table 1 Cross reactivity of monoclonal antibody against SudanⅠ

由表1可见，筛选出的抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体与苏丹红Ⅰ的交叉反应率为100%，与苏丹红Ⅲ的交叉反应率为97%，可用于同时检测苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅲ。

2.6 加标回收率检测结果

将添加有不同量苏丹红Ⅰ标准品的辣椒粉样品经体积分数为70%甲醇溶液提取，用建立的竞争间接ELISA方法检测苏丹红Ⅰ含量，测得辣椒粉样品中苏丹红Ⅰ的回收率为52.3%～110%，变异系数为3.2%～8.9%，结果见表2。

表2 苏丹红Ⅰ加标回收率Table 2 Recovery rate of SudanⅠin spiked samples

3 讨论与结论

由于苏丹红的分子质量小，结构简单，只有反应原性而无免疫原性，必须将其与大分子载体偶联后制成人工抗原才能激发有效的免疫反应。选择与载体分子偶联的化学基团至关重要，由于免疫细胞对载体远端的结构识别最强，对与载体连接的部位的反应不敏感，因此，选择的偶联基团应尽量远离半抗原的特征部分如苯环、杂环、氨基、羟基、羧基和杂原子等，这样有利于制备高选择性、高亲和力的抗体[10-11]。由于苏丹红Ⅰ分子上只具备一个可供直接与载体偶联的羟基基团，常规的人工抗原制备方法和免疫程序很难诱发机体产生针对苏丹红的免疫反应。

本实验在前期工作的基础上，采用化学方法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物1-(4-羧基苯基)偶氮-2-萘酚，并在此基础上制备人工抗原，经免疫BALB/c小鼠后，刺激机体产生了针对苏丹红Ⅰ的特异性免疫应答反应，通过杂交瘤细胞技术，成功筛选到抗苏丹红Ⅰ的单克隆抗体，该抗体具有较高的灵敏度和特异性，旨在为进一步建立苏丹红Ⅰ免疫学检测方法并研制快速检测试剂盒研究提供理论基础。

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Monoclonal Antibodies against Sudan I:Preparation of and Application in Indirect Competitive ELISA Detection

QIU Xue-mei，LIU Ren-rong*，XU Ling，MENG Wei，TU Shun，XIE Shao-xia
(College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

Q813.2 ；TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0258-04

2010-04-26

江西省科技厅科技项目(GJJ10595)；江西科技师范学院博士科研启动基金项目

裘雪梅(1981—)，女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：qiuxuemei2165@126.com

*通信作者：刘仁荣(1969—)，男，教授，博士，研究方向为食品安全检测。E-mail：lilirenrong@hotmail.com