中性蛋白酶酶解制备魔芋飞粉淀粉及其性质的研究

谭博文，徐怀德,*，米林峰

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.榆林市产品质量监督检验所，陕西 榆林 719000)

中性蛋白酶酶解制备魔芋飞粉淀粉及其性质的研究

谭博文1，徐怀德1,*，米林峰2

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.榆林市产品质量监督检验所，陕西 榆林 719000)

对中性蛋白酶酶解魔芋飞粉制备淀粉的方法及其性质进行研究。应用单因素和中心组合试验对酶解条件进行优化，用扫描电镜观察淀粉颗粒形貌，然后对淀粉糊的主要性质及指标进行测定。结果表明：中性蛋白酶酶解魔芋飞粉的最佳工艺参数为底物的质量分数2.5%、酶用量818.3U/g底物、温度44.1℃、pH7.1、水解120min。制得淀粉纯度90.09%，其中直连淀粉含量18.20%，支链淀粉含量81.80%，淀粉糊具有较好的溶解度和透明度。魔芋淀粉颗粒为蚕豆形，颗粒粒径为1～9μm，平均为5μm，魔芋淀粉颗粒小不易发生凝沉现象。

中性蛋白酶；魔芋飞粉淀粉；制备；性质

Abstract：Konjac fly powder was prepared by neutral protease hydrolysis from konjac starch and its properties were investigated. Results indicated that the optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 2.5%, alkaline protease concentration of 818.3 U/g, hydrolysis temperature of 44.1 ℃ and hydrolysis time of 120 min. The purity of prepared starch reached up to 90%, which contained 18.20% amylose and 81.80% amylopectin. Konjac starch paste exhibited excellent solubility and transparency. Konjac starch granules were broad bean shape with particle sizes ranging from 1 to 9μm, averaged at 5μm.

Key words：neutral protease；konjac fly powder starch；preparation；property

魔芋(Amorphophallus rivieriDurieu)是天南星科魔芋属多年生草本植物，具有降低血脂、降低血糖、减肥、防治肠胃消化系统疾病功能[1]。我国是世界上最大的魔芋生产国，对魔芋研究集中在魔芋葡甘聚糖，魔芋的加工主要生产魔芋精粉(葡甘聚糖)，年产量达5000吨左右，在精粉加工过程中会产生大量质量轻、颗粒小的粉末，称为魔芋飞粉[1]，占精粉质量分数的30%～40%，全国年产飞粉1500～2000吨。而魔芋飞粉含蛋白质质量分数20%左右，淀粉40%左右，具有很高的利用价值，庞杰等[2]就利用魔芋飞粉提取生物碱，用于防治植物虫害。赵姗姗[3]、Englysl等[4]研究了用酶解法制备魔芋飞粉高F值寡肽。翟琨等[5]对魔芋淀粉理化特性进行了研究，魔芋飞粉仅以低价饲料或作为干燥剂出售[6-7]，利用率不高。魔芋飞粉中淀粉的制备和性质研究较少。为此，本实验研究中性蛋白酶酶解制备魔芋飞粉淀粉，并以常用的玉米、红薯淀粉对比研究其特性，以期为魔芋淀粉进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

魔芋飞粉 陕西安康秦东食品有限公司；玉米淀粉和红薯淀粉 市售。

中性蛋白酶(酶活50000U/g) 沃尔森公司；考马斯亮蓝G-250 上海化学试剂站分装厂；支链、直连淀粉标品 北京索莱宝科技有限公司；α淀粉酶(酶活4000U/g) 上海蓝季生物科技有限公司；牛血清白蛋白 Sigma公司。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；KDC-40低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；PHS-3C数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；UV-1700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；RE-5220D旋转蒸发仪 上海长城仪表厂；SIM-FD5505P真空冷冻干燥机 德国西门子公司；JSM-6360LV型扫描电子显微镜 日本电子株式会社；DMBA400型数码显微镜 Motic China Group Co. Ltd。

1.2 方法

1.2.1 魔芋淀粉的制备工艺流程

魔芋飞粉→按1:45(g/mL)的料液比加水在50℃溶解1.5h→离心去上清液(4000r/min，30min)→加水、调pH值、加蛋白酶液恒温酶解→离心去上清液(4000r/min，15min)→沉淀水洗2次，45℃烘箱中烘干即得魔芋淀粉

1.2.2 中性蛋白酶酶解魔芋飞粉条件的确定

以残留物淀粉含量为指标，在单因素试验基础上，选择底物质量分数2.5%，酶解时间120min，以pH值、温度、加酶量为试验因素，采用中心组合设计(CCD)优化中性蛋白酶对魔芋飞粉的酶解条件。中心组合试验设计见表1。

表1 中心组合试验设计的三因素水平编码表Table 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.3 淀粉颗粒形貌观察

1.2.3.1 光学形貌观察

以水和甘油体积比为1:1的溶液作溶剂，制备淀粉乳。取淀粉乳滴于载玻片上，盖上盖玻片。用数码显微镜观察淀粉颗粒的形貌。

1.2.3.2 淀粉颗粒的扫描电子显微镜观察

把双面胶固定在样品台上。取少量淀粉均匀地洒在双面胶上，然后真空喷金处理。样品保存于干燥器中，经过短暂干燥后，用扫描电子显微镜观察并拍摄具有代表性的淀粉颗粒形貌。

1.2.4 淀粉糊性质分析

1.2.4.1 淀粉糊的透明度

取1.0g绝干试样，加蒸馏水100mL，配制质量浓度为0.01kg/L淀粉乳，在沸水浴中加热，搅拌20min，并不时加入蒸馏水以保持淀粉糊的原有体积，然后冷却到25℃。以蒸馏水为空白，在620nm波长处，用分光光度计测淀粉糊的透光率。

1.2.4.2 淀粉糊的冻融稳定性

配制质量浓度为0.06kg/L的淀粉乳，于沸水浴中加热搅拌20min，用水调制淀粉糊质量浓度至原质量浓度，冷却至室温，置于－15～－20℃的冰箱内，冷冻24h后取出自然解冻，在3000r/min条件下离心20min，去掉上清液，称取沉淀物质量，计算析水率。

式中：I为析水率/%，m1为淀粉糊质量/g；m2为沉淀物质量/g。

1.2.4.3 淀粉糊的凝沉性

配制质量浓度为0.01kg/L的淀粉糊，置于25mL的具塞刻度试管中，在25℃条件下静置，每隔一段时间记录上层清液的体积，用清液的体积分数随时间的变化来绘制曲线，从而表示淀粉糊的凝沉性。

1.2.4.4 淀粉糊的溶解度和膨胀度

称取5g样品，加入100mL水，置于离心管中，在沸水浴加热30min，每5min振1次。将水浴后的样品冷却至室温，用3000r/min的转速离心15min，将离心后样品的上清液和沉淀物分开，烘干后称量，并按下式计算溶解度和膨胀度。

式中：m1为溶解淀粉质量/g；m2为淀粉质量/g，以干基计；m3为膨胀淀粉质量/g；S为溶解度/%。

1.2.5 主要指标测定方法

淀粉含量的测定用GB 5009.9—85《食品中淀粉含量的测定》[8]；蛋白质含量测定以牛血清白蛋白为标准作标准曲线，用考马斯亮蓝法测定[9]；水分的测定参考文献[10]；粗脂肪的测定参考文献[11]；灰分的测定参考文献[12]。

1.2.6 双波长法分光光度法测定魔芋直链淀粉和支链淀粉含量

1.2.6.1 吸收光谱图及测定波长的选择

图1 直链淀粉和支链淀粉全波段扫描图谱Fig.1 Full-wavelength range spectra of amylase and amylopectin

1mg/mL直链淀粉和支链淀粉标品分别与碘反应，在波长450～800nm扫描[13]，见图1。确定直链淀粉的测定双波长为λ1=564nm和λ2=506nm，支链淀粉的测定双波长为λ3=729nm和λ4=539nm。

1.2.6.2 直链淀粉的回归方程

分别移取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL质量浓度1mg/mL直链淀粉标准液于50mL容量瓶中，加入蒸馏水30mL，以0.1mol/L HCl溶液调至pH3.5左右，加入碘试剂0.5mL，并用蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白，用1cm比色杯在波长为564、506nm处测定Aλ1、Aλ2，即得ΔA直=Aλ2－Aλ1。直链淀粉的回归方程：C直/(mg/mL)=0.0856ΔA直－0.0158，相关系数R2=0.998。

1.2.6.3 支链淀粉的回归方程

分别移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mL质量浓度为1mg/mL支链淀粉标准液于50mL容量瓶中，其他处理方法与直链淀粉回归方程相同。测定波长为729nm和543nm。支链淀粉的回归方程为C支/(mg/mL)=0.0819 ΔA支－0.0147，相关系数R2=0.9988。

1.2.6.4 直链淀粉、支链淀粉含量的测定

样品过60目筛，称取样品0.1g左右(精确至1mg)，置于50mL容量瓶中。加0.5mol/L KOH溶液10mL，在沸水浴中加热10min，取出，以蒸馏水定容至50mL静置。取样品液2.5mL两份，均加蒸馏水30mL，以0.1mol/L HCl溶液调至pH3.5左右，样品中加入碘试剂0.5mL，空白不加碘试剂，然后定容至50mL。静置20min，以样品空白液为对照，分别测定506、564、729、539nm处吸光度。得到ΔA直=Aλ2－Aλ1，ΔA支=Aλ4－Aλ3。淀粉含量按照下列公式计算。

总淀粉/%=直链淀粉＋支链淀粉

式中：X1为查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量/mg；X2为查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量/mg；m为样品质量/g。

2 结果与分析

2.1 中性蛋白酶中心组合设计酶解魔芋飞粉条件的确定

中性蛋白酶中心组合设计酶解魔芋飞粉试验结果见表2，回归方程的显著性检验结果见表3。经过统计分析得到的数学模型为：Y=79.66+4.46X1+2.90X2－2.87X3+1.23X1X2－0.36X1X3－1.23X2X3－1.71X12－5.71X22－5.31X32。

表2 中心组合试验结果Table 2 Central composite design layout and experimental results

表3 回归方程的显著性检验Table 3 Variance analysis (ANOVA) for the developed regression equation

由表3可以看出，模型P＜0.01，表明该模型极显著。模型的复相关系数为0.9525，说明该模型能够解释95.25%响应值的变化，拟合程度良好[14]。

根据各因素与对应自变量的编码转化公式，可以得到各因素的最佳水平值，即中性蛋白酶酶解魔芋飞粉的最适反应条件为酶解120min、底物质量分数2.5%、pH7.1、温度44.1℃、加酶量818.3U/g，在此条件下淀粉含量能达到84.22%。为了证实模型的预测值与实测值之间的拟和程度，验证实验结果淀粉含量达到84.15%，预测值与实验值之间具有良好的拟和性，表明了模型的有效性。

酶解后魔芋淀粉再经过水洗2次烘干得到淀粉含量高的魔芋淀粉，其中含淀粉90.09%、蛋白质2.06%、脂肪0.42%、水分6.5%、灰分0.45%、其他0.48%，双波长法分光光度法测得魔芋淀粉直连淀粉含量18.20%、支链淀粉含量81.80%。

2.2 魔芋淀粉颗粒形貌观察

2.2.1 淀粉颗粒的光学形貌观察

魔芋淀粉颗粒观测如图2所示，通过对比观测魔芋淀粉发现其颗粒明显比玉米淀粉和红薯淀粉的小，部分魔芋淀粉中间有裂纹，可能是在魔芋飞粉生产过程中，部分淀粉受到机械作用而损伤所致；玉米淀粉和红薯淀粉颗粒多呈圆形和多边形且脐点明显，而魔芋淀粉由于颗粒小看不清脐点、轮纹且颗粒之间大小相差较大。

图2 淀粉颗粒形貌Fig.2 Morphology of starch granules from different sources

2.2.2 淀粉颗粒扫描电子显微镜(SEM)观察

图3 淀粉颗粒SEM照片Fig.3 Scanning electron micrographs of starch granules from different sources

淀粉颗粒扫描电子显微镜观察见图3，对比可以看出，魔芋淀粉颗粒较小，用电镜标尺对淀粉颗粒的粒径进行估测，平均为5μm，而玉米淀粉颗粒的平均粒径最大，平均可达12μm，其次为红薯淀粉。从电镜可以看出魔芋淀粉颗粒形状复杂多样，有纺锤形、多边形、菱形等多种形状。部分淀粉颗粒表面有凹陷，有的颗粒表面有絮状连黏物，可能是淀粉结合少量蛋白质有关。淀粉颗粒的大小和形状取决于其来源。研究淀粉粒结构，对于鉴别淀粉来源，了解和改进淀粉性质，有着重要的意义。淀粉颗粒度的大小会影响淀粉的离心沉降速度、流变学特性，从而影响淀粉提取和加工。

2.3 淀粉糊的理化性质

表4 各种淀粉糊的部分理化性质Table 4 Physical and chemical properties of starch pastes from different sources %

由表4可知，魔芋淀粉支链淀粉含量高，透光率高。透光率愈大，淀粉糊的透明度愈大。支链淀粉的含量对糊的透明度有一定的影响，支链淀粉含量越高，透明度越大。魔芋淀粉析水率介于红薯淀粉和玉米淀粉之间，可知魔芋淀粉的冻融稳定性较好，红薯淀粉的冻融稳定性最好。因此魔芋淀粉适宜应用在果冻、饮料等食品加工中。淀粉的溶解度和膨胀度是淀粉性质的一项基本指标，能反映淀粉样品与水的结合能力。从表中可以看出，魔芋淀粉的溶解度和膨胀度都高于红薯淀粉和玉米淀粉。

2.4 淀粉糊的凝沉性

图4 淀粉糊的凝沉曲线Fig.4 Retrogradation curves of starch pastes from different sources

由图4可以看出，在整个凝沉过程中，红薯淀粉和玉米淀粉在9h内发生凝沉；魔芋淀粉在18h内持续凝沉。凝沉主要是由于直链淀粉分子间的结合形成较大的颗粒或束状结构，当体积增大到一定程度时，就形成了沉降。而魔芋淀粉颗粒小，支链淀粉含量高，空间阻隔作用大凝沉较慢[15]，所以淀粉糊不易发生凝沉现象。

3 结 论

3.2 魔芋淀粉颗粒多为蚕豆形，无脐点、轮纹；魔芋淀粉颗粒粒径为1～9μm不等，平均为5μm。魔芋淀粉支链淀粉含量高，所以魔芋淀粉糊具有较好的透明度，较好的冻融稳定性，同时魔芋淀粉具有较好的溶解度和膨胀度。从颗粒观察可以看出魔芋淀粉的颗粒小，所以魔芋淀粉不易发生凝沉现象。

[1] 高佩英. 魔芋学[M]. 北京:中国农业出版社, 2004:15-16.

[2] 庞杰, 张莆生, 肖丽霞. 魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验[J]. 农业工程学报, 2003, 19(4):188-192.

[3] 赵珊珊, 干信. 魔芋飞粉高F值寡肽的研究[J]. 化学与生物工程, 2005(1):10-12.

[4] ENGLYSL H N, KINGMAN S M, CUNRNINGS J H. Classification and measurement of nutritionally important starch fractions[J]. Eur J Clin Nutr, 1992, 46(Suppl 2):33-50.

[5] 翟琨, 覃海兵, 洪雁. 魔芋淀粉理化性质研究[J]. 食品科学, 2008, 29(9):59-61.

[6] 江萍, 夏先林, 秦礼康, 等. 魔芋飞粉基质生料发酵研究[J]. 饲料研究, 1998, 20(9):3-6.

[7] 夏先林, 江萍, 李时春, 等. 复合益微发酵魔芋飞粉的饲用价值研究[J]. 根食与祠料工业, 2003(2):24-26.

[8] GB 5009.9—85 食品中淀粉含量的测定[S].

[9] 陈荃. 生物化学研究技术[M]. 北京:科学出版社, 2002:95-97.

[10] GB/T 5009.3—2003 食品中水分的测定[S].

[11] GB/T 5009.6—2003 食品中脂肪的测定[S].

[12] GB/T 5009.4—2003 食品中灰分的测定方法[S].

[13] 陈毓荃. 生物化学试验方法和技术[M]. 北京:科学出版社, 2002.

[14] 袁志发, 周静芋. 试验设计与分析[M]. 北京:高等教育出版社, 2000.

[15] 杜双奎, 于修烛, 杨雯雯, 等. 扁豆淀粉理化特性分析[J]. 农业机械学报, 2007, 38(9):82-86.

Preparation of Konjac Fly Powder by Neutral Protease Hydrolysis and Its Properties

TAN Bo-wen1，XU Huai-de1,*，MI Lin-feng2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Yulin Products Quality Supervision and Inspection Institute, Yulin 719000, China)

TS231

A

1002-6630(2010)18-0041-05

2009-12-23

陕西省陕南突破发展基金项目(2006ZKC(二)04-34)

谭博文(1985—)，男，硕士研究生，主要从事园艺产品贮藏与加工研究。E-mail：tany4210@163.com

*通信作者：徐怀德(1964—)，男，副教授，学士，主要从事软饮料、果品蔬菜贮藏与加工、天然产物提取研究。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn