野马追类黄酮的超声提取及其抗氧化活性研究

王卫东，王乃馨，李姣姣，张同天，李 超*

(徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008)

野马追类黄酮的超声提取及其抗氧化活性研究

王卫东，王乃馨，李姣姣，张同天，李 超*

(徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008)

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计优化超声提取野马追类黄酮的最佳工艺参数，并研究野马追类黄酮对DPPH自由基的清除效果，最后与其他提取方法进行比较。结果表明：超声提取野马追类黄酮的最佳工艺参数为液料比11.3:1(mL/g)、超声温度58℃和超声时间29min，此时得率为1.142%；当野马追类黄酮质量浓度在6.556～32.78μg/mL范围内，其对DPPH自由基的清除率为46.90%～61.06%，且存在明显的量效关系。与其他提取方法比较，超声提取时间短、得率高。

野马追；类黄酮；超声提取；Box-Behnken试验设计；抗氧化活性

Abstract：Ultrasonic extraction (UE) of flavonoids from the whole plant ofEupatorium lindleyanumDC was optimized using Box-Behnken design and response surface methodology on the basis of single factor experimental results. The scavenging effect of the extract against DPPH free radicals was also studied. Results indicated that the optimal extraction conditions of flavonoids from the whole plant ofEupatorium lindleyanumDC were liquid-to-ratio of 11.3:1, ultrasonic extraction temperature of 58 ℃and ultrasonic treatment time of 29 min. The extraction rate of flavonoids under these optimal extraction conditions was 1.142%.It was calculated that the content of flavonoids inEupatorium lindleyanumDC ranged from 6.556 to 32.78 μg/mL. The scavenging rate of flavonoids fromEupatorium lindleyanumDC against DPPH free radicals was between 46.90% and 61.06% in a dosedependent manner. Compared with other extraction techniques, UE exhibited higher yield and shorter extraction time.

Key words：Eupatorium lindleyanumDC；flavonoid；ultrasonic extraction；Box-Behnken design；antioxidant activity中图分类号：O623.54 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)18-0050-05

野马追(Eupatorium lindleyanumDC.)是菊科植物轮叶泽兰的全草，中医药理认为本品苦、平，具有清热解毒、祛痰、定喘、降血压和提高人体免疫力等功效，可用于治疗慢性气管炎、支气管炎、高血压等疾病[1-2]。野马追主要含有类黄酮等生物活性成分，常用的类黄酮提取方法有水煎煮法、乙醇回流提取等，但都存在提取时间长等缺点；而超声提取作为一种优良的提取方法，具有操作简便快捷、提取时间短、提出率高等特点，目前己广泛应用在生物活性物质的提取方面[3-8]。本实验对野马追类黄酮的超声提取及抗氧化活性进行研究，旨在为野马追类黄酮的进一步研究与开发应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野马追 安徽亳州药材市场；芦丁对照品 中国药品生物制品检定所；乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

标准检验筛 浙江上虞华美仪器纱筛厂；风选中药粉碎机 山东省青州市精诚机械制造有限公司；FA2104N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；SHZ-D(Ш)循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；热回流装置自行组装；数显式电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂；KBS-250型数控超声波细胞粉碎机(20KHz，250W)昆山市超声仪器有限公司；756紫外-可见分光光度计上海成光仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

按文献[2]方法稍加修改：精密称取芦丁20mg置于250mL容量瓶中，加60%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，配成0.08mg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL具塞刻度试管中，先依次分别加60%乙醇溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0mL，再加入0.3mL 5% NaNO2溶液摇匀后静止6min，再加入0.3mL 10% Al(NO3)3溶液摇匀后静止6min，最后加入4mL 1mol/L NaOH溶液后用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀后静止10min，以60%乙醇溶液为空白参比，于波长510nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，得回归方程：A=11.688C－0.0301，R2＝0.9990，结果表明在0.008～0.040mg/mL之间线性良好。

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 超声提取

野马追粉碎后过40目筛，精确称取约3g，置于烧杯中，加入一定体积一定体积分数乙醇溶液后，按照试验设计设置好超声功率、超声温度和超声时间(占空比固定为5s/5s)后开动超声制样，然后将提取液过滤，定容，测定。

1.3.2.2 水煎煮法

野马追粉碎后过40目筛，精确称取约3g，置于圆底烧瓶中，加入水50mL，沸腾1.5h后，过滤，定容，测定。

1.3.2.3 乙醇回流提取

野马追粉碎后过40目筛，精确称取约3g，置入圆底烧瓶中，加入60%乙醇溶液50mL，100℃水浴加热回流2.5 h后，过滤，定容，测定。

1.3.3 工艺优化设计

1.3.3.1 单因素试验

分别以乙醇体积分数、液料比、超声功率、超声温度和超声时间为影响因素考察其对得率的影响。

1.3.3.2 Box-Behnken试验设计

表1 Box-Behnken试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取液料比、超声温度和超声时间3个影响因素，采用3因素3水平的响应曲面分析方法，试验因素与水平设计见表1。共15个试验点：其中12个为析因点，3个为中心点。

设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：EY为预测响应值；xi和xj为自变量代码值；β0为常数项；βi为线性系数；βij为交互项系数；βii为二次项系数；ε为随机误差。按照Box-Behnken试验设计的统计学要求，对上述方程的各项回归系数进行回归拟合。

1.3.4 得率的计算

1.3.5 DPPH法测定野马追类黄酮的抗氧化性

按文献[9]方法稍加修改：将1mL不同质量浓度野马追类黄酮(6.556、13.112、19.668、26.224、32.780μg/mL)与 3mL 1.44×10-4moL/L的DPPH自由基反应，测定反应平衡时(30min)的吸光度，研究不同质量浓度的野马追类黄酮对DPPH自由基的清除率。

式中：K为野马追类黄酮对DPPH自由基的清除率/%；A0为DPPH溶液的吸光度；A为加试样后DPPH溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对类黄酮得率的影响

图1 乙醇体积分数对得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction rate

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，类黄酮得率先增加后降低，在乙醇体积分数为60%时得率达到了最大值。这是因为类黄酮为偏极性化合物，根据相似相溶原理，通过调节乙醇和水的配比改变乙醇溶液的极性，使其与此类黄酮的极性更加接近，从而使得率最大。因此选择乙醇体积分数为60%进行后续试验。

2.1.2 液料比对类黄酮得率的影响

图2 液料比对得率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on flavonoids extraction rate

由图2可知，随着液料比的增加，类黄酮得率先增加后降低，在液料比为10:1(mL/g)时得率达到最大值。这是因为前期溶剂量越大，有效成分浸出越完全，得率也就越大；但当溶剂过大时，探头式超声能量对沉滞低层的野马追颗粒的空化效应和机械效应等效应的强度减弱，影响了超声提取的效果，同时会造成溶剂和能源的浪费，并给后序的浓缩工作带来困难。因此选择液料比为10:1(mL/g)进行后续试验。

2.1.3 超声功率对类黄酮得率的影响

图3 超声功率对得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on flavonoids extraction rate

由图3可知，随着超声功率的增加，类黄酮得率先增加后降低，在超声功率为75W时得率达到最大值。这是因为前期超声功率增加，提取的推动力增加，但当超声功率达到75W以上时，可能由于超声功率过大，类黄酮受到了破坏，导致得率下降。同时考虑到KBS-250型数控超声波细胞粉碎机设备的特点，固定超声功率为75W进行后续试验。

2.1.4 超声温度对类黄酮得率的影响

由图4可知，随着超声温度的增加，类黄酮得率先增加后降低，在超声温度为60℃时得率达到最大值。这是因为前期温度增加增加了传质速度；但超过60℃之后，类黄酮受到破坏，同时造成溶剂挥发损失。因此选择超声温度为60℃进行后续试验。

图4 超声温度对得率的影响Fig.4 Effect of temperature on flavonoids extraction rate

2.1.5 超声时间对类黄酮得率的影响

图5 超声时间对得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

由图5可知，随着超声时间增加，类黄酮的得率也随着增大；但当超声时间达到35min以后，可能由于超声时间过长，类黄酮受到了破坏，导致得率下降，因此选择超声时间为35min。

2.2 Box-Behnken试验设计

2.2.1 模型的建立及其显著性检验

表2 Box-Behnken试验结果Table 2 Box-Behnken design layout and experimental results

利用Design expert V7.0.0统计软件通过逐步回归对表2试验数据进行回归拟合，得到野马追类黄酮得率(EY)对以上3个因素的二次多项回归模型为：

对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the developed quadratic regression model

由该模型的方差分析表3可见：模型具有极显著性(P＜0.01)，失拟项(P＞0.05)不显著以及和RSN(信噪比)为17.67，可知回归方程拟合度和可信度均很高，实验误差较小，故可用此模型对超声辅助提取野马追类黄酮的工艺结果进行分析和预测。

2.2.2 响应曲面分析与优化

根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析液料比，超声温度和超声时间对得率的影响。其响应曲面及其等高线如图6～8所示，3组图直观地反映了各因素对响应值的影响。

图6 液料比、超声温度及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of liquid-to-material ratio and ultrasonic temperature on flavonoids extraction rate

图7 液料比、超声时间及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of liquid-to-material ratio and ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

图8 超声温度、超声时间及其交互作用对得率影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour plots illustrating the interactive effects of temperature and ultrasonic treatment time on flavonoids extraction rate

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。比较3组图并结合表3中P值可知：模型的一次项x1(P＜0.01)极显著，x2(P＜0.05)显著，x3(P＞0.05)不显著；交互项x1x2(P＜0.05)显著，x1x3(P＜0.01)极显著，x2x3(P＞0.05)不显著；二次项x12(P＜0.01)、x22(P＜0.01)和x32(P＜0.01) 都极显著，表明各影响因素对得率的影响不是简单的线性关系。

为进一步确定最佳提取工艺参数，对所得方程进行逐步回归，删除不显著项，然后求一阶偏导，并令其为0，可得最佳工艺参数为液料比11.3:1(mL/g)，超声温度58.1℃和超声时间28.7min，此时野马追类黄酮的最佳得率为1.164%。

2.2.3 验证实验

为检验Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述最优提取条件进行野马追类黄酮的提取实验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：液料比11.3:1(mL/g)、超声温度58℃和超声时间29min，在此条件下进行3次平行实验，实际测得的平均得率为1.142%，与预测值基本相符, 因此，基于Box-Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠, 具有实用价值。

2.3 野马追类黄酮对DPPH自由基的清除率

图9 野马追类黄酮对DPPH自由基活性的清除率曲线Fig.9 DPPH free radical scavenging rates of flavonoids fromEupatorium lindleyanumDC at different concentrations

由图9可以看出，野马追类黄酮对DPPH自由基有明显的清除作用，在质量浓度6.556～32.78μg/mL的范围内，野马追类黄酮清除DPPH自由基的能力为46.90%～61.06%，且其对DPPH自由基的清除效果与质量浓度之间存在明显的量效关系。

2.4 不同提取方法的比较

表4 不同提取方法得率的比较Table 4 Comparison of extraction rates of flavonoids using different extraction methods

由表4可以看出，超声提取野马追类黄酮得率分别比水煎煮法和乙醇回流提取的得率高56.2%和9.6%；但是超声提取的提取时间仅29min，而其他提取方法则需要若干小时，提取时间大大缩短。由此可知，超声提取是一种非常有效的提取野马追类黄酮的方法。

3 结 论

3.1 由单因素和Box-Behnken试验设计及其分析结果获得超声提取野马追类黄酮的最佳工艺参数为液料比11.3:1(mL/g)，超声温度58℃和超声时间29min，此时得率为1.142%。

3.2 在质量浓度6.556～32.78μg/mL的范围内，野马追类黄酮清除DPPH自由基的能力为46.90%～61.06%，且其对DPPH自由基的清除效果与质量浓度之间存在明显的量效关系。

3.3 本实验还讨论比较超声提取与其他提取方法的效果差异，结果表明，超声提取时间短，得率高。

[1] 王新风, 蒋继宏, 蒋海龙. 野马追总黄酮提取得率的比较研究[J]. 江苏中医药, 2005, 26(10):43-44.

[2] 陈健, 姚成. 野马追中总黄酮的测定[J]. 南京师范大学学报, 2004, 4(2):16-18.

[3] HUANG Wen, XUE An, NIU Hai, et al. Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systemsin vitro[J]. Food Chemistry,2009, 114(3):1147-1154.

[4] FU Caili, TIAN Haijun, LI Quanhong, et al. Ultrasound-assisted extraction of xyloglucan from apple pomace[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2006, 13(6):511-516.

[5] CHEN Fang, SUN Yangzhao, ZHAO Guanghua, et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspberries and identification of anthocyanins in extract using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2007,14(6):767-778.

[6] 姜宁, 刘晓鹏, 姜顺日, 等. 相思菇多糖超声波辅助提取工艺研究[J].食品科学, 2009, 30(2):98-101.

[7] 周蓉, 邹怀波, 陈三宝. 超声波提取虎刺中总黄酮的工艺研究[J]. 食品科学, 2008, 29(11):176-178.

[8] 董发明, 白喜婷. 响应面法优化超声提取杜仲雄花中黄酮类化合物的工艺参数[J]. 2008, 29(8):227-231.

[9] DU Qizhen, ZHENG Juyue, XU Yuanjin. Composition of anthocyanins in mulberry and their antioxidant activity[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(5):390-395.

Ultrasonic Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Flavonoids from the Whole Plant ofEupatorium lindleyanumDC

WANG Wei-dong，WANG Nai-xin，LI Jiao-jiao，ZHANG Tong-tian，LI Chao*
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

2009-12-18

王卫东(1971—)，男，讲师，博士，研究方向为功能性食品添加剂及配料。E-mail：wwd.123@163.com

*通信作者：李超(1978—)，男，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：chaoge002@163.com