一株产黏植物乳杆菌发酵豆乳条件优化

李程程，陈晓红，姜 梅，董明盛*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

一株产黏植物乳杆菌发酵豆乳条件优化

李程程，陈晓红，姜 梅，董明盛*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

采用分离自泡菜的植物乳杆菌发酵豆乳。通过单因素试验和响应曲面设计确定豆乳的最优发酵条件。结果表明：制作酸豆乳的最佳工艺条件为：豆水比1:8(m/V)、4g/100mL蔗糖+3g/100mL乳糖、接种量4%、33℃发酵8h。在此条件下，发酵酸豆乳黏度最大可达3589.1mPa·s、酸度48.88oT、感官86分，菌落总数1.2×109CFU/mL。

植物乳杆菌；响应曲面法；大豆；豆乳；工艺条件

Abstract：Soybean was used as the fermentation substrate to produce fermented soybean milk byLactobacillus plantarumisolated from pickle. The optimal production conditions of fermented soybean milk were explored by single-factor experiments and response surface methodology. Soybean-to-water ratio of 1:8 (m/V), sucrose amount of 4 g/100mL and lactose amount of 3 g/100mL, inoculum amount of 4%, incubation time of 8 h and incubation temperature of 33 ℃ were found optimum, and under these optimum conditions, the maximum viscosity of fermented soybean milk was 3589.1 mPa·s, the acidity 48.88oT, the sensory evaluation score 86, and the total bacterial count 1.2 × 109CFU/mL.

Key words：Lactobacillus plantarum；response surface methodology；soybean；soybean milk；process condition

酸豆乳是一种以大豆为原料，经乳酸菌发酵制成的一种外观颇似酸奶的具有独特豆香味的时尚健康食品。对豆乳进行发酵不仅为保存豆浆提供了一种方法而且有可能调整或改善其风味与质构，从而使之更适合西方人的口味[1]。乳酸细菌以及双歧杆菌培养物发酵豆乳，对人类有相当大的益处[2-3]，酸豆乳含有丰富的植物蛋白、不饱和脂肪酸、人体必需的18种氨基酸和提高人体免疫机能的大豆低聚糖和大豆异黄酮等功能成分[4]，且不含胆固醇和乳糖，是高血压及乳糖不耐症患者的良好选择。乳酸菌的作用众所周知，另外，大豆相对于牛乳原料在中国更易获得，大大降低了生产成本。有学者研究证明乳酸杆菌广泛的被用作益生菌，大豆是这些益生菌生长的良好基质，干酪乳杆菌[5-6]、瑞士乳杆菌[3,7]、发酵乳杆菌[8]、嗜酸乳杆菌[9]、鼠李糖乳杆菌[10]都已经被证明能在豆乳中良好生长。

国内外对酸豆乳的研究已经很多，但植物乳杆菌作为发酵剂的研究甚少，经过拉丝实验已经证明该植物乳杆菌是一种能够产黏的乳酸菌，经过苯酚-硫酸法测定后发现该黏性物质是多糖，利用能够产生多糖的乳酸菌发酵豆乳，可以增加酸豆乳的黏度以及稳定性，从而降低稳定剂的添加量，同时，作为乳酸菌的一种次级代谢产物，多糖具有一定的降血脂、降血压、抗氧化、抑菌、抗癌等重要功能，极大的提高了酸豆乳的益生特性，对人体更加有益。

考虑到大豆中含有丰富的植物蛋白，且该菌种来源于传统的泡菜食品，同为植物原料，发酵性能会有所提高，使菌种能够更好的适应生长环境。本研究将以本实验室分离的一株产黏植物乳杆菌为发酵剂，发酵豆乳生产高黏度酸豆乳，通过单因素试验和响应曲面设计确定酸豆乳生产的最优发酵条件。以期为以后的工业化生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

小黄豆、蔗糖、乳糖 市售。

1.2 菌种与培养基

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)由本实验室分离。

MRS培养基[11]：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、K2HPO42.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温-801.0mL、蒸馏水1000mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌20min。

1.3 工艺流程

原料→精选大豆→浸泡过夜(可随季节调节时间)→磨浆→过滤→加配料→均质→分装→灭菌→冷却接种→发酵→成品

1.4 方法

1.4.1 发酵用菌种的处理

植物乳杆菌按体积分数2%的接种量接种于MRS培养基中，经过两次活化后于5000r/min离心15min，取菌体悬浮于0.85g/100mL的生理盐水中备用。

1.4.2 豆水比对发酵豆乳的影响

挑选籽粒饱满无霉变的大豆，用清水浸泡过夜，选取1:6、1:8、1:10(m/V)的豆水比进行实验，121℃灭菌15min，待豆乳冷却至30℃时按4%接种量接种乳酸菌，放入30℃培养箱恒温发酵10h，测定酸度、固形物含量。

1.4.3 碳源种类对发酵豆乳的影响

在灭好菌的豆乳中分别加入质量浓度4g/100mL的蔗糖、乳糖、D-半乳糖、D-麦芽糖、葡萄糖、果糖，按4%接种量接入菌种，于30℃发酵10h，测定其酸度。

1.4.4 碳源添加量对豆乳发酵的影响

1.4.4.1 乳糖添加量的选择

取20mL豆乳(豆水比1:8)，分别添加0、1、2、3、4、5、6g/100mL乳糖，灭菌后冷却到30℃左右，按4%的接种量接种，30℃恒温发酵10h，测定其酸度。

1.4.4.2 蔗糖添加量的选择

取20mL豆乳(豆水比1:8)，分别添加0、1、2、3、4、5、6g/100mL蔗糖，灭菌后冷却到30℃左右，按4%的接种量接种，30℃恒温发酵10h，测定其酸度。

1.4.5 接种量对发酵豆乳的影响

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，分装灭菌后冷却到30℃左右，分别按体积分数0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量接种，30℃恒温发酵10h，测定其酸度。

1.4.6 发酵温度对发酵豆乳的影响

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，灭菌后冷却到30℃左右，按4%的接种量接种，分别于27、30、33、36、39、42、45℃条件下发酵10 h，测定其酸度。

1.4.7 发酵时间对发酵豆乳的影响

取20mL豆乳(豆水比1:8)，添加一定量的蔗糖和乳糖，分装灭菌后冷却到30℃左右，按4%的接种量接种，于33℃条件下分别发酵0、2、4、6、8、10、12h，发酵结束后测定其酸度。

1.5 指标测定

酸度：采用滴定酸度法[12]；总固形物含量：采用干燥法[12]；黏度：采用NDJ-8S黏度计；菌落总数：采用GB/T 4789.35—2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[13]。

感官评价(总分100分)：评价标准见表1。

表1 感官评价标准Table 1 Standards of sensory evaluation for fermented soybean milk

1.6 响应曲面法优化酸豆乳发酵条件的设计

在单因素试验结果的基础上，以酸豆乳的酸度、黏度、感官为指标，主要影响因素为碳源添加量(A)、接种量(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)，采用4因素3水平的Box-Behnken设计方法[14]，每组试验重复3次。

表2 响应曲面试验因素水平表Table 2 Factors and levels in the response surface design

1.7 数据处理

采用Design Expert 7.0软件处理，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 豆水比的确定

表3 豆水比对发酵豆乳的影响Table 3 Effects of soybean-to-water ratio on some physico-chemical parameters and sensory evaluation of fermented soybean milk

由表3可见，随着水量的不断增加，豆浆的固形物含量逐渐降低。从状态来看，豆水比为1:6和1:8时酸豆乳凝乳较好，没有乳清析出；其他处理则有不同程度的乳清析出，且很软。从酸度来看，豆水比为1:6、1:8及1:10时酸豆乳酸度都相近。所以，从经济、组织状态以及酸度方面综合考虑，豆水比定为1:8。

2.2 碳源的确定

碳源决定益生菌的产酸量，大豆中的碳水化合物含量只有15%左右，而且还有一些种类的碳源不能被益生菌所利用。经过浸泡、分离等处理工序后，豆浆中可供益生菌利用的碳源损失较多，所以需要添加必要量的碳源以促进益生菌产酸、凝乳[15]。

2.2.1 不同种类的碳源对酸豆乳品质的影响

图1 不同碳源对酸豆乳酸度的影响Fig.1 Effect of carbon source type on the acidity of fermented soybean milk

由图1可见，蔗糖、乳糖、葡萄糖为碳源时酸豆乳凝乳均很好，果糖、D-麦芽糖、D-半乳糖为碳源时，凝乳较软，其中添加蔗糖的酸豆乳滋味酸甜适口，其他糖酸甜味较淡，且果糖的有酸涩味。添加乳糖产酸量最高。故确定蔗糖和乳糖为添加碳源。

2.2.2 乳糖和蔗糖添加量对发酵豆乳的影响

图2 不同蔗糖和乳糖添加量对酸豆乳酸度的影响Fig.2 Effect of amounts of added sucrose and lactose as carbon sources on the acidity of fermented soybean milk

由图2可知，当乳糖添加量为3g/100mL时，酸豆乳酸度最高为49°T。添加蔗糖4g/100mL时酸度达到最大为50°T。当蔗糖添加量4g/100mL和乳糖添加量3g/100mL时，酸豆乳口感最佳，无乳清析出，且较黏稠。故选择乳糖添加量为3g/100mL，蔗糖添加量为4g/100mL。

2.3 接种量对发酵豆乳的影响

图3 不同接种量对酸豆乳酸度的影响Fig.3 Effect of inoculum amount on the acidity of fermented soybean milk

酸度是衡量乳酸菌发酵优良的一个重要指标，酸度高说明乳酸菌能很好的利用糖类产酸，酸度低说明乳酸菌没有很好的生长。由图3可知，随着接种量的增加，酸度呈上升趋势，到4%时达到最高，随后有所降低，这是因为乳酸菌发酵要利用糖类等一些物质，接种量低时，菌种不能完全利用糖类，接种量太高，糖类又不足，因此，只有接种量适宜时，才能使糖类的利用发挥最大的效用。故选择接种量为4%。

2.4 发酵温度对发酵豆乳的影响

图4 不同发酵温度对酸豆乳酸度的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the acidity of fermented soybean milk

由图4可以看出，27～39℃范围内随着发酵温度的升高，酸度逐渐升高，之后酸度开始降低，33℃和36℃时酸度基本相同，39℃时酸度达到最高，但33℃时感官较好，且优考虑到植物乳杆菌的最适生长温度是30～35℃，所以确定33℃为最佳发酵温度。

2.5 发酵时间对发酵豆乳的影响

图5 不同发酵时间对酸豆乳酸度的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the acidity of fermented soybean milk

发酵时间的长短对于酸豆乳的工厂化生产有很大的影响，时间越短，可以更有效的节省资源。由图5可见，随着发酵时间的延长，酸度逐渐升高，8h和12h时酸度都较高，故确定8h为最佳发酵时间。

2.6 响应曲面试验设计及结果

在单因素试验结果基础上，确定豆水比为1:8，乳糖添加量为3g/100mL的条件下，进行响应面试验设计，结果见表4。

表4 响应曲面试验设计与结果Table 4 Response surface central composite design matrix and experimental results

2.6.1 回归模型的建立

用Design Expert 7.0软件对表8中的数据进行分析，得出4个影响因素与黏度、酸度、感官3个响应值之间的二次回归方程：

黏度模型的P＜0.0001，说明方差模型达到显著，失拟项P=0.0086＜0.05，说明模型拟合显著，模型的总决定系数R2达0.9472，表明响应值的变化有94.72%来自所选因素；AB对黏度的交互作用显著。

酸度模型的P=0.0153＜0.05，说明方差模型达到显著，失拟项P=0.183＞0.05，说明模型拟合不显著，模型的拟合程度很好。模型的总决定系数R2达0.7704，表明响应值的变化有77.04%来自所选因素；BC对酸度的交互作用显著。

感官模型的P=0.006＜0.05，说明方差模型达到显著，失拟项P=0.0838＞0.05，说明模型拟合不显著，模型的拟合程度很好。模型的总决定系数R2达0.8673，表明响应值的变化有86.73%来自所选因素；BD对感官的交互作用显著。

2.6.2 响应面分析

图6 碳源和接种量交互影响黏度的响应曲面Fig.6 Response surface plot illustrating the interactive effects of inoculum amount and carbon source amount on the viscosity of fermented soybean milk

图7 发酵时间和接种量交互影响酸度的响应曲面Fig.7 Response surface plot illustrating the interactive effects of fermentation time and inoculum amount on the acidity of fermented soybean milk

由图6可以看出，随着接种量和碳源的增加，黏度先增高后下降，其中碳源下降的较快；由等高线图可以看出，碳源相对于接种量等高线陡峭说明碳源对黏度的影响较接种量更显著。由图7可以看出，当接种量在3%～4%范围时酸度随接种量的增加先升高后降低，当接种量在4%～5%时酸度随接种量的增加逐渐降低。由等高线图可以看出发酵时间相对于接种量等高线陡峭，说明发酵时间对酸度的影响更显著。由图8可以看出，随着接种量和发酵温度的增加，感官分值先增高后下降，由等高线可以看出碳源相对于接种量等高线较陡峭说明碳源对感官影响更显著。

图8 发酵温度和接种量交互影响感官评价值的响应曲面Fig.8 Response surface plot illustrating the interactive effects of fermentation temperature and inoculum amount on the sensory score of fermented soybean milk

2.6.3 配方的优化组合及验证

根据Box-Behnken试验所得结果和二次多项式方程，利用Design-Expert软件计算出最佳条件选择：蔗糖添加量4.39g/100mL、接种量3.89%、发酵时间8.08h、发酵温度32.83℃，为了便于操作将上述条件参数修订为蔗糖4g/100mL、接种量4%、发酵时间8h、发酵温度33℃，在此最佳条件下，酸豆乳黏度3021.5mPa·s、酸度47.13oT、感官得分86分，菌落总数1.2×109CFU/mL。根据软件给出的最优条件进行验证实验，黏度为3589.1mPa·s，酸度为48.88oT，感官得分为86，菌落总数1.2×109CFU/mL，与软件给出的结果较为吻合，可见该实验设计方法可靠高效。

3 结论与讨论

大豆在国内占有大量的比例，易于获得，价格相对于牛乳较低，如果能够采用发酵法生产一种类似于酸乳的乳酸菌发酵豆乳产品，将会给人们生活带来极大好处。关于乳酸菌发酵生产酸豆乳，前人也已经做过很多研究。至于发酵豆乳用的乳酸菌，发现泡菜里面有些乳酸菌能够有效利用植物中的成分使之产酸，在国内泡菜资源也很丰富，而且微生物结构比较复杂，广泛存在着优良的乳酸菌，可以作为分离筛选优良菌种的来源，泡菜中主要存在着植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌。

植物乳杆菌广泛存在于泡菜中，是一种安全无公害的有益菌种。考虑到大豆和泡菜原料均为植物性原料，因此有一定的发酵相似性。植物乳杆菌在发酵豆乳上具有其他均无法比拟的优越性，它既可以高效率的利用乳糖转化为乳酸，又可以利用乳清中的残余蛋白质[16]。

通过单因素试验和响应曲面试验，最后确定利用植物乳杆菌发酵不添加任何辅料的大豆乳的最佳工艺配方是：乳糖加量3g/100mL、蔗糖添加量4g/100mL、接种量4%、发酵时间8h、发酵温度33℃。采用该菌种发酵豆乳具有一定的优越性，无论是在产酸、产黏，还是菌落总数上都好于其他菌株。

贺晓光等[17]采用从市售酸奶和自制泡菜中分离的乳酸菌进行豆乳发酵，在36℃条件下发酵需要24h才可以发酵完全，而本实验中只需33℃发酵8h即可。大大缩短了发酵时间，有利于生产工艺的进行。刘希山等[18]采用嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌混合培养发酵豆乳，其黏度最高可达到2200mPa·s，本实验采用植物乳杆菌发酵，酸豆乳黏度可达3589.1mPa·s。Kamaly[19]采用双歧杆菌发酵豆乳，发酵结束后酸豆乳的菌落总数在107～108个数量级，与本实验酸豆乳中的菌落总数为108～109个数量级基本一致，并且双歧杆菌发酵时要求严格厌氧，操作要求严格不利于大规模的工业化生产，而植物乳杆菌是兼性厌氧菌，有利于工业化生产。

通过本实验研究，证明植物乳杆菌在发酵豆乳上确实具有良好的特性，尤其是在产黏上远好于其他菌株。前人的研究结果均表明利用植物乳杆菌生产出一种高黏度发酵豆乳是切实可行的。

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Optimization of Fermentation Conditions for Viscosity-producingLactobacillus plantarumto Prepare Soybean Milk

LI Cheng-cheng，CHEN Xiao-hong，JIANG Mei，DONG Ming-sheng*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0201-05

2010-04-19

国家“863”计划项目(2007AA10Z354)；江苏省农业科技自主创新项目(CX(08)113)

李程程(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：lichengcheng1162@sina.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：dongms@njau.edu.cn