酸浆宿萼中β-隐黄质体外淬灭单线态氧能力评价

2010-10-19惠伯棣

食品科学 2010年17期

关键词：酸浆单线正己烷

蔡靳，赵婷，惠伯棣*，宫平

(北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

酸浆宿萼中β-隐黄质体外淬灭单线态氧能力评价

蔡靳，赵婷，惠伯棣*，宫平

(北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

目的：从酸浆(Physalis alkengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)宿萼中制备β-隐黄质(β-cryptoxanthin)，应用微弱发光测量方法对β-隐黄质体外淬灭单线态氧的能力进行评价。方法：用正己烷萃取酸浆宿萼中的β-隐黄质酯后经皂化获得单体，使用C18-HPLC-PDA对制备物进行定性和定量。用次氯酸钠-双氧水反应产生单线态氧，使用微弱发光测量仪检测制备组分淬灭单线态氧的能力。结果：经C18-HPLC-PDA鉴定，制备物中的类胡萝卜素主要为β-隐黄质。微弱发光测量仪的数据显示：β-隐黄质的存在能减少次氯酸钠-双氧水单线态氧体系中产生的最大光子计数，且存在量效关系。0.049～0.49g/L的β-隐黄质可减少50%的最大光子计数。

宿萼；β-隐黄质；单线态氧

Abstract：Objective:To assess the ability ofβ-cryptoxanthin from the calyx ofPhysalisalkengiL. var.franchetii(Mast.)Makino to quenchin vitrosinglet oxygen. Methods:β-cryptoxanthin eater was extracted from the calyx ofPhysalisalkengiL.var.franchetii(Mast.) Makino withn-hexane and then saponified to produceβ-cryptoxanthin fraction. The fraction was identified and quantified on C18-HPLC-PDA. Based on the reaction between NaClO and H2O2, singlet oxygen was produced. Singlet oxygen quenching ability of theβ-cryptoxanthin fraction was determined on ultra-weak luminescience analyzer. Results:By C18-HPLCPDA, the prepared fraction was identified asβ-cryptoxanthin. The data from ultra-weak luminescience analyzer suggested that theβ-cryptoxanthin fraction was able to reduce the maximum number of photon generated from the reaction solution in positive correlation with its amount.β-Cryptoxanthin with an amount ranging between 0.049 g/L and 0.49 g/L resulted in a 50% reduction of maximum photon number.

Key words：calyx；β-cryptoxanthin；singlet-oxygen

酸浆(Physalis alkengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)为茄科(Solanaceae )酸浆属(P.alkekengi)的一种多年生草本植物，又名“红姑娘”、“红灯笼”等。酸浆果实为球状浆果，外部的宿萼宽大，呈灯笼形囊状。酸浆原产于中国，南北方均有野生品种[1]。酸浆的根及全草可入药，被列入《本草纲目》，具有清热、利咽、化痰、利尿等功能。酸浆的果实可生食、糖制、醋渍或制果浆，宿萼有显著的清热解毒功能[2]。酸浆的果实和宿萼中含有丰富的类胡萝卜素，其中包括β-隐黄质酯[3-5]。酸浆的果实和宿萼中的β-隐黄质酯可被水解制成β-隐黄质单体。

β-隐黄质(β-cryptoxanthin)为一种天然类胡萝卜素，其化学结构已完全明确(图1)，系统命名为3-羟基-β-胡萝卜素，分子式为C40H56O，平均相对分子质量为552.872[4]。近几年的研究表明β-隐黄质具有预防心血管疾病、提高免疫力、抗癌等多种功能，可成为食源中重要的功能因子[4-5]。

图1 β-隐黄质Fig.1 Molecular structure ofβ-cryptoxanthin

单线态氧(1O2)是处于激发态的分子氧。在许多生命活动中单线态氧都起着重要的作用，与生物膜损伤、细胞衰老和癌症等疾病有密切关系。在本项研究中，使用次氯酸钠-双氧水反应体系产生单线态氧(1O2)(式(1))。该反应在产生单线态氧的同时定量释放光子。

微弱发光测量技术[8]是将发光的生物或化学样品置于黑暗的环境中，用灵敏度极高的光子计数器接受来自样品的微弱光，将其转换成电信号，从而获得样品的发光信息[6-9]。在本研究中，用微弱化学发光检测仪对次氯酸钠-双氧水反应体系产生的光子计数，以反映单线态氧产生的数量。本研究拟从β-隐黄质淬灭单线态氧能力的角度探索其健康功能的量效关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸浆来自于河北秦皇岛地区。

甲醇、乙醇、正己烷、30%过氧化氢、氢氧化钾、次氯酸钠、四氢呋喃均为分析纯试剂北京化工厂；乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯迪马公司；柱层析用硅胶(60～100目) 青岛海洋化工厂。

1.2 仪器与设备

Jasco PU-2080 Plus溶剂输送系统；Jasco UV-2075检测器；Superiorex ODS S5色谱柱(4.6mm×150mm，5μm) Shiseido公司；MultiSpec-1501型紫外-可见分光光度计 Shimadzu公司；BPCL-2-JZSH型(双反应池)微弱发光分析仪中国科学院生物物理研究所。

1.3 方法

1.3.1 酸浆宿萼中总类胡萝卜素的萃取

将干燥(含水量为13%)的酸浆宿萼剥离，放入粉碎机中进行粉碎。粉碎的样品过20目标准筛，收集20目以下组分。称取1kg 20目以下的样品粉末置于大三角瓶内，加入4L正己烷，进行30min齿式搅拌(120r/min)后使用负压抽滤，收集滤出的萃取液。残渣重复萃取6次。合并收集的萃取液，将其置于旋转蒸发器的旋转瓶中，在－0.08MPa条件下进行浓缩脱溶，由于萃取液体积较大，浓缩温度定为45℃。收集浓缩物。

1.3.2 β-隐黄质的制备

称取1g浓缩物溶于50mL正己烷中，形成真溶液。配制10g/100mL KOH-乙醇溶液。将浓缩物的正己烷溶液与10g/100mL KOH-乙醇溶液按体积比1:1比例混合。混合液在充氮、避光和搅拌条件下反应过夜。将反应液转移至分液漏斗中，用稀盐酸将pH值调至中性，加入等体积的水，摇匀，静置10min，弃去下相，反复多次。收集上相，在40℃、－0.08MPa的条件下浓缩至适当体积，保持浓缩物为真溶液。

在26cm×1.8cm直径的层析柱中干法装填硅胶固定相。用正己烷润洗柱床。将浓缩物上样，用正己烷洗脱6个柱体积后改用95%的乙醇溶液。样品在柱上可分为两个明显的色带。收集先洗脱下来的色带组分在40℃、－0.08MPa的条件下浓缩脱溶。

1.3.3 β-隐黄质制备物中类胡萝卜素组成的C18-HPLC分析

定量称取β-隐黄质制备物，使用丙酮溶解并定容。溶液10000r/min离心10min。取上清液用于HPLC分析。

HPLC条件：色谱柱为Superiorex ODS S5(4.6mm×150mm，5μm)；流动相A为乙腈-水(9:1，V/V)；流动相B为乙酸乙酯。线性梯度洗脱：B在20min内从0%升至100%，流速为1mL/min，检测波长为450nm，进样量为20L[4]。依据各组分的保留时间，参考惠伯棣等[4]的报道对各组分定性。测定各组分的峰面积，计算β-隐黄质在总类胡萝卜素中所占比例(式2)。如果β-隐黄质在总类胡萝卜素中所占比例超过97%，采用UV-VIS法测定组分中β-隐黄质的纯度。

1.3.4 β-隐黄质制备物纯度的UV-VIS测定

称取一定量β-隐黄质制备物，用正己烷定容。用紫外-可见光分光光度计测量溶液在449nm波长处的吸光度，并根据公式(3)计算其中β-隐黄质的含量[4-5]。

式中：x为样品中β-隐黄质的含量/g；V为样品溶液的体积/mL；A为样品溶液在449nm波长处的吸光度；A1%1cm为吸光系数，在1 cm光程长的比色杯中1g/100mL质量浓度溶质的理论吸收值，在此为2200。

1.3.5 β-隐黄质制备物体外淬灭单线态氧能力测定

称取一定量β-隐黄质制备物浓缩物溶于四氢呋喃中，配制4.9、0.49、0.049和0.0049g/L质量浓度的β-隐黄质样品液。

微弱发光测量仪 (BPCL)测量条件及测量方法：双样品数据采集间隔为0.1s，收集时间50s。在样品测量杯中顺次加入0.15mL次氯酸钠和0.1mL样品，混匀后将测量杯放入样品池中，关闭检测室门，启动接收光子计数信号，待基线稳定后，注入0.15mL双氧水，同时开始计时记录光子计数信号。在参比样品测量杯中的操作同上，样品溶液被换为四氢呋喃。记录每个样品的反应时间-光子计数图。由于该反应受到多种环境因素的影响，为确保实验结果的真实性，每个样品至少重复3次，结果取平均值。按式(4)计算淬灭率[10-12]。

2 结果与分析

2.1 β-隐黄质制备物的类胡萝卜素组成

酸浆宿萼中的β-隐黄质是以酯的形式存在，经过皂化可水解成单体。这一过程在惠伯棣等[4]的报道中已详尽描述。在本研究中，皂化产物采用柱层析纯化制备β-隐黄质。根据惠伯棣等[4]的报道，图2中保留时间为11.92min的组分为β-隐黄质，β-隐黄质在制备物中的总类胡萝卜素构成上占有很大比例。根据归一化法计算达98.1%。

图2 β-隐黄质制备物的C18-HPLC色谱图Fig.2 C18-HPLC profile of the preparedβ-cryptoxanthin fraction

2.2 β-隐黄质制备物中β-隐黄质的含量

图3 β-隐黄质制备物的电子吸收光谱图Fig.3 Electronic absorption spectrum of the preparedβ-cryptoxanthin fraction inn-hexane

由于β-隐黄质制备物中β-隐黄质占总类胡萝卜素含量的比例很大，其中β-隐黄质的含量可用UV-VIS法测定，测定结果显示：制备物中β-隐黄质单体含量为9.956%。图3为从UV-VIS上获得的β-隐黄质制备物电子吸收光谱图。该光谱的特征包括最大吸收波长和VIII/VII值与已报道的β-隐黄质的光谱特征一致[4]。