天然产物抗氧化活性体外评价方法研究进展

刘微微，任 虹*，曹学丽，徐春明，王巧娥

(北京工商大学化学与环境工程学院，植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048)

天然产物抗氧化活性体外评价方法研究进展

刘微微，任 虹*，曹学丽，徐春明，王巧娥

(北京工商大学化学与环境工程学院，植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048)

客观准确地评价天然抗氧化剂的抗氧化活性是抗氧化研究领域的热点问题，本文对近年来天然产物抗氧化活性体外评价的方法及作用机制进行综述，介绍目前常用的化学测定方法和细胞评价方法的原理及技术进展，并分析两者的区别。

抗氧化剂；抗氧化活性；评价方法

Abstract：Antioxidant activity evaluation of natural products has become a hot topic. In this paper, current evaluation methods and antioxidation mechanisms of natural products have been reviewed. The principles and mechanisms of chemical determination and cellular evaluation of antioxidant activity have also been discussed. In addition, the difference is described between both methods.

Key words：antioxidant；chemical methods for evaluating antioxidant activity ；cellular evaluation for evaluating antioxidant activity

自由基是外层轨道含有未配对电子的基团，其化学性质活泼，且种类多，可攻击细胞内包括 DNA、蛋白质、脂质、糖类、有机酸等几乎所有生物分子，破坏性极强[1]。医学研究表明，各种自由基所引发的氧化作用是导致身体中各组织器官损伤、病变的重要原因之一，人类许多重大疾病如动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、癌症以及衰老过程均与自由基造成的氧化损伤有关。因此，抗氧化活性物质的研究与开发成为国内外学者研究的热点[2-4]。化学合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙醋(PG)和特丁基对苯二酚(TBHQ)曾一度受到青睐，但通过动物实验发现它们有一定毒性和致畸作用，使得人们对合成抗氧化剂产生了疑虑。天然抗氧化剂安全、无毒，符合人们对健康、安全的新需求。大量临床研究表明，多种天然植物包括蔬菜、水果、谷物及中草药等都含有黄酮、多酚、鞣质、皂苷及生物碱等抗氧化活性成分，在一定程度上减少了机体的氧化损伤[5-6]。因此从资源丰富的天然植物中活性跟踪寻找高效、低毒、价廉的抗氧化剂成为该领域研究的一个重要方向，其中抗氧化活性评价方法对天然抗氧化剂的研究开发至关重要。目前研究评价抗氧化活性的方法主要有化学测定方法和细胞抗氧化评价方法，本文综述了这两类抗氧化活性测定方法的作用机制及其技术进展，并对它们进行了对比，以期为抗氧化性活性评价体系的建立提供参考。

1 抗氧化活性的化学测定方法

抗氧化的化学测定方法主要在化学反应容器中采用自氧化反应方法，测定抗氧化剂针对某一种或某一类自由基的清除或抑制作用，作用机制主要有以下几点：1)抗脂质过氧化；2)清除或抑制自由基；3)影响抗氧化酶的生物活性；4)减少DNA的氧化损伤。

1.1 以脂质过氧化为基础的测定方法

在生物体内，癌症的发生及老化都与体内脂肪的氧化有关，脂质过氧化是一个十分复杂的过程，受许多因素干扰，在脂质过氧化反应早期，多不饱和脂肪酸碳链上可形成共轭双键，可直接采用紫外分光光度法定量测定[7]，后期脂质最终氧化成醛、酮[8]。目前，脂质氧化多用化学、物理或感官的方法检测，化学方法包括：过氧化值(peroxide value，PV) 法、共轭二烯过氧化物法、硫氰酸铁法(ferric thioeyanate method，FTC)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)、2,4-二硝基苯肼法、克雷斯实验法(Kreis test)和茴香胺值(anisidine value)等，见表1。

李均等[9]对中华补血草根提取物对大豆卵磷脂脂质体体系中所产生的共轭二烯过氧化物和丙二醛的抑制率进行测定，结果发现提取物作用96h后对共轭二烯过氧化物和丙二醛的抑制率分别为79.03%和93.36%，比阳性对照槲皮素(对二者抑制率分别为84.67%和96.54%)略低，显示中华补血草根提取物具有较明显的抗氧化活性。硫氰酸铁盐(FTC)比色法基于酸性条件下脂质过氧化物可将Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+与硫氰酸根离子形成红色络合物，在波长480～515nm处有最大吸收，吸光度越小表明物质的抗脂质过氧化能力越强。Rowena等[10]采用FTC法对5种菲律宾甘薯Dakol、Emelda、Violet、PSBSP和Haponita的抗氧化活性进行了测定，甲醇提取浸膏质量浓度为10mg/mL时，Haponita的抗氧化活性最强，抑制率为(99.4±0.9)%，Violet最弱，抑制率为(87.4±1.0)%，而且Violet的抗氧化活性与Dakol、Emelda、PSBSP的差异不显著(P＞0.05)。Hanachi等[11]采用TBA法考察中草药Berberis vulgaris的抗氧化活性，并以BHT和VE为参照，发现在相同质量浓度(0.2mg/mL)条件下，乙醇提取物活性最强，抑制率达(27.26±1.07)%，其次是BHT抑制率为(20.29±0.23)%、甲醇提取物为(16.80±0.23)%、VE为(6.68±0.25)%，水提取物活性最低，抑制率为(6.53±0.29)%。

1.2 以清除自由基为基础的测定方法

体内自由基过剩，会对机体产生损伤。通过测定抗氧化剂清除自由基的能力来评价抗氧化活性，常用的方法有DPPH法、DMPD法、ORAC法等，见表2。

DPPH法[12]基于二苯代苦味酰基(DPPH)自由基在有机溶剂中的稳定性及其在波长517nm处的强吸收，抗氧化剂存在时，与其孤对电子配对而使光吸收消失或减弱，从而测得抗氧化剂对DPPH自由基的清除效果。因其快速、简便、灵敏，该法成为评价天然抗氧化剂的最常用方法之一。Si等[13]从大青杨树叶中分离得到两个新的酚苷类化合物异大齿杨苷A(1)和B(2)、5个已知的酚苷类化合物大齿杨苷(3)、柳匍匐苷(4)、杨属灵(5)、杨属灵A(6)、柳皮苷(7)以及2个已知的酚酸类化合物P-香豆酸(8)和咖啡酸(9)。采用DPPH自由基清除法和TEAC法测定它们的抗氧化活性，发现化合物1～6和9具有较强的抗氧化活性，IC50值分别为6.68、6.61、6.75、6.84、6.76、6.79mmol/L和5.92mmol/L；TEAC值分别为1.21、1.28、1.26、1.05、1.69、1.60mmol/L和2.00mmol/L。

DMPD(二甲基对苯二胺)法由 Fogliano等[14]提出，在酸性条件下，DMPD被氧化生成稳定的DMPD+·，它在波长505nm处有最大吸收峰，根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。Gil等[15]采用DMPD法和DPPH法测定比较石榴汁、红葡萄酒、绿茶饮料的抗氧化活性，发现这两种方法的实验结果基本一致，都显示出石榴汁的抗氧化活性(18～2TEAC)强于红葡萄酒和绿茶饮料的活性(6～8TEAC)。

表1 脂质过氧化评价方法Table 1 Evaluation methods for lipid peroxidation

表2 自由基清除能力评价方法Table 2 Evaluation methods for scavenging capacity to free radicals

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法[16-17]采用β-藻红蛋白(βphycoerythrin，β-PE)为荧光指示蛋白，以偶氮化合物2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐[2,2’-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH]、Cu2+-H2O2体系作为脂过氧化自由基或羟自由基的来源，以VE 类似物Trolox为参照。β-PE受到自由基攻击时，在一定的波长下荧光度不断衰减，根据其荧光强度衰减曲线变化计算出样品的自由基清除能力。Wang等[18]利用ORAC法对12种水果和5种果汁进行了抗氧化活性测定，其中草莓的ORAC值最高，其次为李子和橘子，而果汁中葡萄汁的ORAC值最高，其次为柚汁和番茄汁。

总自由基清除抗氧化能力(total peroxyl radical-trapping antioxidant parameter，TRAP) 法是由 Wayner 等[19]1985年提出，该法采用2,2-偶氮(2-脒基丙烷)(ABAP)作为过氧化物自由基的引发剂，以氧浓度的降低作为评价氧化的速率。Boumerfeg等[20]采用TRAP法研究浆果薯蓣的甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的抗氧化活性，结果表明TRAP法得到的抗氧化活性顺序与酶法(细胞色素C还原法)得到的顺序基本一致，乙酸乙酯提取物的抗氧化活性＞氯仿提取物＞甲醇提取物。

Winston等[21]建立的总氧自由基清除能力(total oxyradical scavenging capacity，TOSC)法克服了机体某种特定抗氧化成分难以准确反映生物体实际抗氧化应激能力的局限性，TOSC法以气相色谱或液相色谱为检测手段检测机体的总氧自由基清除能力，其优势是能较全面地反映机体的总抗氧化能力，是目前测定总氧自由基的常用方法。Kwondo等[22]采用TOSC法研究9种日常饮料的抗氧化活性，并以抗坏血酸作为对照，结果发现9种饮料的抗氧化能力依次为：抗坏血酸＞乌龙茶＞红茶＞茉莉花茶＞葡萄汁＞可可＞绿茶＞速溶咖啡＞李子汁＞咖啡，其中咖啡的抗氧化能力仅为抗坏血酸的1/7。

Benziei等[23-24]等建立铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP) 法，利用抗氧化剂将三吡啶三嗪三价铁[TPTZ-Fe3+]还原为蓝色的三吡啶三嗪二价铁[TPTZ-Fe2+]，反应结果常以Fe2+当量表示。FRAP法简便、快捷、灵敏度高、重现性好。Luximon等[25]采用FRAP和TEAC法研究了不同时期收获的肉桂管的营养器官和生殖器官的抗氧化活性，结果表明生殖器官的抗氧化活性较强，其中豆荚的抗氧化活性最强，TEAC值为(992±0.4)μmol/L；FRAP值为(811±23)μmol/L。

Valkonen 等[26]还报道二氯荧光素二乙酸酯(dichorofluorescin - diacetane，DCFH-DA)法也是测定总的自由基清除能力。AAPH产生的过氧自由基氧化DCF H-DA生成二氯荧光黄(dichlorofluorescein，DCF)，DCF有强荧光(激发波长480nm，发射波长526nm)，在波长504nm处也有吸收，因此可用荧光法或分光光度法检测。

1.3 测定抗氧化剂对抗氧化酶活性的影响

机体内清除自由基的酶系统主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶类组成，都是铁卟啉蛋白酶，催化体内氧化酶的毒性产物H2O2分解。在正常情况下，机体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基被细胞的SOD歧化为H2O2，后者再由细胞浆的CAT和GSH-Px催化降解为水和氧。

李兴泰等[27]考察连翘醇提物的抗氧化活性，测定连翘醇提物对6周龄雌性小鼠血液中SOD、CAT和GSHPx酶活性的影响，以VE为阳性对照，发现当醇提物含量为0.4g/kg时，SOD、CAT和GSH-Px酶活力分别为(202.0±27)、(10.1±1.8)U/mg 蛋白和(44.8±9.5)U/mg 蛋白；当醇提物含量为0.8g/kg时，三者酶活力分别升高至(225±26)、(12.7±2.4)U/mg 蛋白和(47.6±5.8)U/mg 蛋白，随醇提物含量递增酶活增加。Jodynis-Liebert等[28]研究了耧斗花的乙醇和乙酸乙酯提取物及异金雀儿黄素对扑热息痛介导的大鼠的氧化应激的影响，发现它们可以升高由扑热息痛引起的各种抗氧化酶活性的降低，CAT升高50%，GSH-Px升高50%，谷胱甘肽还原酶升高50%，谷胱甘肽S2转移酶升高60%，还减少肝中18%～48%的脂质过氧化。

1.4 DNA氧化损伤的测定

DNA是机体中携带遗传信息的重要物质，也是最易受到氧自由基攻击的生物大分子之一。正常情况下，机体可通过自身修复机制及时修补受损的DNA分子，维持遗传物质的稳定性。但当发挥抗氧化作用的防御体系不健全时，机体细胞的自身修复系统不能及时地对损伤加以修复，最终导致各种疾病的发生。DNA被氧化时，鸟苷酸上C-8是最易发生损伤的位点，由此形成的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是评价DNA氧化损伤的最常用指标。彗星实验是公认的DNA损伤检测方法，通过检测DNA链断裂反映损伤情况。Braz等[29]对麻醉剂丙泊酚是否会对手术病人产生DNA损伤及脂质过氧化进行了研究，选择进行了90min手术的病人为实验者，丙泊酚浓度控制在2～4μg/mL之间，分别收集初期、麻醉诱导后、手术末期和术后第1天的静脉血，采用彗星实验测定白细胞DNA的损伤。彗星实验及血浆动力学实验表明4次取样测定结果未有大区别，未发现白细胞中DNA损伤，血浆中丙二醛含量也未发生变化，表明丙泊酚不会诱导DNA损伤及脂质过氧化。

上述化学测定方法均是在一定的反应容器内通过自氧化方法测定天然产物的抗氧化活性，因具有简单、快捷、处理量大等优点而被广泛应用。这些方法对检测生物制品、植物提取物以及单体化合物的体外抗氧化能力提供了重要的信息，并在研究氧化与疾病关系方面发挥着重要的作用。但随着研究的不断深入，抗氧化活性化学测定方法的局限性逐渐显现，Wolfe等[30]采用ORAC、TEAC及FRAP三种方法对槲皮素、山奈酚、杨梅素、儿茶素、咖啡酸、没食子酸、表儿茶素、表儿茶素酸酯共8个单体化合物的抗氧化活性进行测定，结果发现，在ORAC法中活性最强的3个为槲皮素、儿茶素和咖啡酸，在TEAC法中为没食子酸、表儿茶素和表儿茶素酸酯，而咖啡酸活性很弱；在FRAP法中，最强的3个依次为槲皮素、杨梅素和山奈酚，而没食子酸活性不强。大量实验结果研究表明，没有一种化学检测方法可以全面、准确地评价待测物的抗氧化活性。

2 抗氧化活性的细胞评价方法

每种化学方法不可能全面评价抗氧化活性的原因主要在于[31-32]：1)抗氧化活性的化学测定方法无法真实模拟生理环境，没有考虑药物跨膜进入细胞、药物吸收及其与载体或酶等生物大分子之间的相互作用。2)体内新陈代谢作用大大增加了活性物质抗氧化能力的不确定性，未考虑代谢毒性及生物有效利用性，许多情况下，有活性的化合物可能不是原本的化合物而是其代谢产物。3)生物体抗氧化反应途径多样复杂，各体系间相互作用，通常用不同方法测得的抗氧化活性的数据相关性很差，因为不同方法的侧重点不同，如ORAC法、TRAP法和TOSC法测定的是抗氧化抑制体系中活性自由基引起的氧化还原反应的能力，而FRAP法测定的是被测物的还原能力。4)抗氧化剂与生物体液一般是混合的，其中每一种物质对不同测量方法的贡献不同；通常，对于天然抗氧化剂，以抑制底物氧化降解的方法用的较多；对于生物试样，则多用测定其清除自由基能力的方法。5) 测定的样品大多为植物提取物，成分复杂，其抗氧化作用无法用单一的机制解释。天然抗氧化剂往往具有多功能性，当用以一种抗氧化作用机理为主的方法进行测定时，就决定其测定体系氧化条件，而不同氧化条件又影响氧化反应动力学和体系组成，这些相关参数的影响不可能用一种单机理测定方法来评价。同时，抗氧化活性还受很多因素如在水相和有机相间分配效应、氧化条件和环境以及氧化底物物理状态等的影响。动物模型实验结果具有直接说明意义，但此方法昂贵耗时，不适宜初期筛选。因此为了寻找适合人体生理环境的、高效低毒的天然抗氧化剂，人们提出以细胞为载体评价抗氧化剂对细胞的抗氧化活性。

以细胞培养为基础的活性筛选模型是用来研究药物分配进入细胞膜、药物吸收及与载体或酶等生物大分子相互作用的有效方法，目前，Liu等[33]和Wolfe等[34-35]提出了抗氧化活性的细胞筛选方法(cellular antioxidant activity assay，CAA)，以结肠癌细胞Caco-2、肝癌细胞HepG2及乳房癌细胞MCF-7为靶细胞，以2＇,7＇-二氯荧光黄二乙酯(DCFH-DA)为荧光探针，在细胞水平上检测抗氧化剂对自由基氧化作用的抑制效果，初步筛选了25种水果的70%甲醇粗提物抗氧化活性，发现蓝莓、石榴、草莓、蔓越桔、李子、樱桃、苹果、红葡萄活性较强，EC50值分别为2.53、2.95、5.46、15.6、22.9、27.3、34.4mg/mL和45.3mg/mL，并检测了其中黄酮类化合物的活性，发现B环3',4'-羟基取代的黄酮醇类如槲皮素、山奈酚、表儿茶素酸酯、木犀草素、桑黄素和杨梅素等的活性较强，EC50值分别为8.9、11.9、14.2、23.8、27.6μmol/L和31.1μmol/L，而异黄酮类不呈现活性。与传统的“试管”化学测定方法相比，在开发抗氧化药物方面，CAA评价方法更具可靠性和说服力，日益被人们认可，对日后抗氧化剂的研究开发将产生更大价值。

3 结 论

抗氧化活性测定的根本标准和目的是客观、准确地评价抗氧化剂的抗氧化效果，既要测定待测物的含量、化学成分及其抗氧化能力，同时还要考虑抗氧化评价方法的灵敏性和稳定性。目前抗氧化活性评价方法很多，各有特色，各有优势和局限性，不可能用一种方法全面准确地反映某一抗氧化剂的抗氧化活性，所以有必要在大量实验研究的基础上，基于不同用途，建立起一系列完整的抗氧化活性的评价体系和方法，以便客观、准确地评价抗氧化效果，并确保结果的可靠性与重现性，从而高效率研究开发活性高、毒副作用低、特异性强的天然抗氧化剂。

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Progress in Evaluation Techniques for Antioxidant Activity of Natural Productsin vitro

LIU Wei-wei，REN Hong*，CAO Xue-li，XU Chun-ming，WANG Qiao-e
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)17-0415-05

2009-12-09

国家“863”计划项目(2007AA092400)

刘微微(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为微生物抗氧化次级代谢物研究。E-mail：liuweiwei731@163.com

*通信作者：任虹(1967—)，女，副研究员，博士，研究方向为天然活性产物化学。E-mail：renhong@th.btbu.edu.cn