凝胶柱层析—考马斯亮蓝染色法测定牛奶中的真蛋白质

张弘，李博斌，曾金红，方魏，郑云峰，孟燕青，夏炜芳

（1．绍兴市质量技术监督检测院，浙江绍兴312071；2．杭州天辰仪器仪器设备有限公司，杭州310013）

凝胶柱层析—考马斯亮蓝染色法测定牛奶中的真蛋白质

张弘1，李博斌1，曾金红1，方魏2，郑云峰1，孟燕青1，夏炜芳1

（1．绍兴市质量技术监督检测院，浙江绍兴312071；2．杭州天辰仪器仪器设备有限公司，杭州310013）

采用凝胶柱层析和考马斯亮蓝染色相结合的方法，对多个品种的牛奶进行检测，详细考察牛奶中蛋白质的分子量分布特征，对牛奶不经过预处理而直接进行检测。结果表明，牛奶中蛋白质分子量绝大部分集中分布在1×104～7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白质所占的比列很小。综合应用牛奶中蛋白质的分子量分布特征和考马斯亮蓝染色法的特性研发出牛奶蛋白质快速检测仪，该仪器体积小、操作简便、检测速度快、灵敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸铵等无机氮，及水解植物和动物蛋白等小分子多肽氮对牛奶中蛋白质检测的干扰，从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白检测问题，可用于现场牛奶真蛋白质快速检测。

牛奶；蛋白质；凝胶柱层析；考马斯亮蓝染色；快速检测仪

0 引言

牛奶及乳制品中含有丰富的蛋白质，但在牛奶收购、生产环节中，质量掺假事件时有发生，尤以“劣质假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件为甚。目前检测蛋白质的国家标准方法是凯氏定氮法，其结果只是氮的质量分数，而不是真正意义上的蛋白质质量分数。这种缺陷造成某些不法分子对牛奶进行掺假，添加硫酸铵、三聚氰胺、水解植物或动物蛋白等含氮物质。要杜绝这类问题，必须建立真蛋白质的检测方法。含氮物质的检测方法目前有：凯氏定氮法、红外光谱法和电泳法等[1-10]。本文采用凝胶柱层析-考马斯亮蓝染色法对牛奶中蛋白质的分子量分布特征进行考察，并结合考马斯亮蓝染色法的特性研发出牛奶蛋白质快速检测仪，解决牛奶中掺假蛋白的检测问题。

1 实验

1.1 材料

取2只有准确来源、不含有其他氮源的纯牛奶和脱脂奶(蛋白质质量分数3.0%,全氮质量分数为0.47%)标样，同时分别向上述空白纯牛奶和脱脂奶中添加质量分数为0.05%和0.10%的外源无机氮物质三聚氰胺、硫酸铵和尿素，及小分子多肽氮物质水解植物和动物蛋白，采用蛋白质分离检测仪测定其蛋白质分子量分布图形和牛奶蛋白质快速检测仪进行直接测定读数。考马斯亮蓝G-250染料作为蛋白质染色剂。

1.2 仪器

蛋白质分离检测仪和牛奶蛋白质快速检测仪(TCDB-3型)。蛋白质分离检测仪是基于凝胶柱层析—考马斯亮蓝染色法的原理设计制造的。其仪器原理、结构及软件系统与酱油蛋白质检测仪(B型)相同[11]。

1.3 方法

本仪器采用标准样品定标的方法，经仪器的自动计算处理后，将溶液中的吸光度转化为蛋白质质量分数，从显示屏上直接读数。

图1为基于考马斯亮蓝染色法的牛奶蛋白质快速检测仪器结构。图1中，由电源发出的复合光，经单色器（滤光镜）得到需要的595 nm单色光，经透镜聚焦后到达比色池，再到接收器（光电池）。光电池将光信号转化为电信号，经前置放大器放大，信号转入A/D转换器，A/D转换器将模拟信号转换成数字信号后送往单片机进行数据处理。操作者将有关信息通过键盘告诉单片机，单片机将处理结果通过显示屏告诉操作者。

图1 考马斯亮蓝染色法的牛奶蛋白质快速检测仪器结构

显色剂的改良：考马斯亮蓝染色测定蛋白质是一种经典的方法，但按传统方法配成的显色剂却存在着溶解不完全、比色池上极易沉积等问题，实际操作时对测定的准确性干扰较大。为此本研究对考马斯亮蓝显色剂中进行了改良，加入了大分子的醇类和酚类物质，新研制的显色剂溶液溶解度好，比色池上沉积很少，且稳定，存放一年不影响测定。

2 结果及分析

2.1 牛奶中蛋白质质量分数及其分布谱图

本研究选取了市场上比较常见的纯牛奶和脱脂奶作为试验对象，探讨牛奶中的蛋白质分子量范围及分布特征。纯牛奶和脱脂奶标样及添加外源含氮物质后的检测结果如图2-图9所示（纯牛奶中添加硫酸铵、水解动物蛋白的图谱分别与图4、图5相似，省略；脱脂奶中添加硫酸铵、水解动物蛋白的图谱分别与图8、图9相似，省略）。

由图2-图9可以看出，纯牛奶图谱上有一个饱满锐尖峰和一峰形不很明显的拐角小峰，而脱脂奶图谱上有2个明显峰形；纯牛奶与脱脂奶胶体乳液中的蛋白质分子量绝大部分集中分布在1×104u,而7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白质所占的比列很小，即这两种牛奶中蛋白质分子量总体分布范围基本一致；但由于脱脂奶中脂肪被去除，导致脱脂奶中脂肪球形成的乳状液胶体体系的破坏，对脱脂奶胶体体系中蛋白质的聚集产生影响，脱脂后大分子量蛋白质的聚集状态的比例明显减少，因而两峰的峰高(对应不同分子量蛋白质的质量分数与比例)有所变化，第一峰的峰高明显减少，第二峰的峰高增加。

图2 纯牛奶标样的图谱

图3 纯牛奶+三聚氰胺的图谱

图4 纯牛奶+尿素的图谱

图5 纯牛奶+水解植物蛋白的图谱

图7 脱脂奶+三聚氰胺的图谱

图8 脱脂奶+尿素的图谱

图9 脱脂奶+水解植物蛋白的图谱

本研究首次对牛奶不经过预处理而直接进行检测。牛奶的蛋白质主要为酪蛋白和乳清蛋白两大类，其分子量分布常用的检测方法是：先将牛奶脱脂，然后调pH值将酪蛋白在等电点时沉淀，洗净后pH值调回已溶解状态，再用电泳法，薄层层析法、高效液相色谱法等方法检测。这些方法检测得到的结果是，牛奶中的蛋白质基本上以单体形式存在，很少量的有二聚体，分子量大致为1×104～7×104u。牛奶不经处理直接测分子量分布，除了本研究，尚未有报导。本研究测得的牛奶蛋白质分子量在1～1×104u左右，不是意味牛奶蛋白中的分子量有几万或约104u，而是牛奶中的部分蛋白质以多个单体聚集的状态存在，脱脂后这部分聚集状态的比例明显减少。

此外，对比图2-图9，纯牛奶和脱脂奶中加入外源性三聚氰胺、硫酸铵和尿素等无机氮，及水解植物和动物蛋白等小分子多肽氮物质后，所得的与它们的标样图谱非常相似，出峰时间段及峰高、蛋白质分子量总体分布范围基本一致，表明这些外援氮添加物对它们的图谱几乎没有影响，也就是对考马斯亮蓝测定纯牛奶与脱脂奶中蛋白质的质量分数几乎没有干扰。

2.2 牛奶蛋白质快速检测仪

牛奶蛋白质快速检测仪的设计原理是基于牛奶中蛋白质的分子量分布特征和考马斯亮蓝染色法的特性。分子量约1 ku以上含氮物中的肽链和考马斯亮蓝结合，在波长595 nm处达到最大吸收值。而通过蛋白质分离检测仪测定的结果表明：牛奶中的蛋白质分子量集中分布在1×104～7×104u，和考马斯亮蓝染色剂的显色作用非常明显，因此灵敏度很高。

2.2.1 线性研究

取蛋白质标准溶液(质量分数1%的卵清蛋白溶液)，分别取体积为10，15，20，25和30 μL，与质量浓度为10 mg/L的20 mL新研制的考马斯亮蓝显色剂混合，按照仪器使用说明书操作，通过快速检测仪的显示值(直接读数)与标准溶液样品中蛋白质质量分数（%）的对应关系(原取样体积)来衡量仪器检测性能的归一性(线性)，结果如图10所示。

图10 牛奶蛋白质快速仪显示值与添加量曲线

由图10可以看出，牛奶蛋白质快速检测仪的响应值与测定样品中蛋白质质量分数，呈良好的线性关系。

2.2.2 方法精密度及仪器的稳定性

以凯氏定氮法测定不含有其它氮源的鲜牛奶为标准，各测定6种牛奶的蛋白质质量分数。样品6次重复测量的数据平行性较好，相对标准偏差RSD都小于1.0%，表明该分析方法的精密度较好，仪器的稳定性或重现性较好。

表1 蛋白质测定结果%

2.2.3 与凯氏定氮法比较及含氮物添加检测实验

向全氮质量分数为0.47%的牛奶(蛋白质质量分数3.21%)中分别添加质量分数为0.05%和0.10%的外源无机物质三聚氰胺氮、硫酸铵氮和尿素氮，及水解植物和动物蛋白等小分子多肽氮，结果如表2所示。

表2 添加含氮物后蛋白质检测实验结果%

由表2可以看出，采用凯氏定氮法测定总氮质量分数，再推算蛋白质质量分数时，会把添加的硫酸铵、尿素和三聚氰胺中含有的氮也计算成蛋白质。对无外源含氮添加物时，牛奶快速检测仪测得的结果同凯氏定氮法测的结果比较接近；表明蛋白质快速检测仪测定的结果则基本上可以真实的反应蛋白质的质量分数，而不受其他氮源添加物的影响，可以克服凯氏定氮法无法消除外源含氮添加物的影响。

3 结论

本研究是通过考马斯亮蓝进行改良，基于马斯亮蓝染色法的特性和牛奶中蛋白质分子量的分布特征研制出牛奶蛋白质快速检测仪。分子量约1 ku以上含氮物中的肽链和考马斯亮蓝结合，在波长595 nm处达到最大吸收值。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和清蛋白两大类，它们的分子量大多在1×104～3×104u；蛋白质分离检测仪检测的结果表明：牛奶中的蛋白质分子量集中分布在1×104～7×104u，和考马斯亮蓝的显色作用非常明显，因此灵敏度很高。牛奶中的其他物质，如脂肪、多糖、维生素等均不与考马斯亮蓝作用，掺假物质，如三聚氰胺、尿素和硫酸铵等基本也不显色，因此能有效识别；而水解植物和动物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白质才能显色，但如果要达到和牛奶相同的显色值，含氮量要达到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白质快速检测仪测定蛋白质，可有效地防止牛奶中掺假蛋白质的干扰，从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白的检测问题，可用于现场牛奶真蛋白质的快速检测。

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Research on determination of protein in milk based on Gel filtration chromatography combined with Coomassie brilliant blue staining

ZHANG Hong1,LI Bo-bin1,ZENG Jin-hong1,FANG-Wei2,ZHENG Yun-feng1,MENG Yan-qing1,XIA Wei-fang1
（1．Shaoxing testing institute of quality and technical supervision,Shaoxing 312071,China；2．Hangzhou Tianchen Instrument Equipment Co.Ltd.,Hangzhou 310013,China）

The objective of this study was to develop a determination method for milk protein based on gel filtration chromatography combined with Coomassie brilliant blue staining,by which varieties of milks were detected and the detailed distribution characteristics of protein molecular weight was investigated in milk.Distribution characteristics was that the molecular weight was mostly concentrated in the(1-7)×104u,the proportion was small for those whose molecular weight was 7×104u or more,and 1×104u below,and combined with the features of Coomassie brilliant blue staining,the rapid detector of milk was developed.That rapid detector is small,fast,sensitive and easy to operate.Moreover,it can effectively eliminate the interference of protein detection in milk by the added inorganic nitrogen materials such as melamine,urea,ammonium sulfate,and small molecule peptide nitrogen materials such as hydrolyzed vegetable and animal proteins,which can fundamentally put an end to detection phenomenon of adulterated protein in milk.It can be used for rapid detection of true milk protein on the spot.

milk;protein;Gel filtration chromatography;Coomassie brilliant blue staining;rapid detector

TS252.7

A

1001-2230（2010）12-0041-04

2010-08-30

国家科技支撑计划项目协作课题(ASJGG08-2)。

张弘(1964-)，男，高级工程师，从事机电类产品检测及自动化研究工作。