辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率

郑娴娴，何金生，付远辉，徐少华，谢灿，石长信，张梅，王小波，洪涛,4

1 安徽医科大学免疫学教研室，合肥 230032 2 北京交通大学生命科学与生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 100052

辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率

郑娴娴1,2，何金生1,2，付远辉2，徐少华2，谢灿1，石长信3，张梅1，王小波1,2，洪涛2,4

1 安徽医科大学免疫学教研室，合肥 230032 2 北京交通大学生命科学与生物工程研究院，北京 100044 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 100052

构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)，并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达，电镜下观察到经 CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为 4.0×1012颗粒数(Virus particle，vp)/mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector，FGAd)FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究，分别用约2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞，流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况，可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较 FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度，显示 HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性，是一种更有价值的疫苗载体。

辅助病毒依赖型腺病毒载体，第一代腺病毒载体，增强型绿色荧光蛋白，转基因表达

Abstract:To investigate the transgenic expressing efficacy of helper-dependent adenoviral vector(HDAd)in vitro, we constructed a HDAd encoding enhanced green fluorescent protein(EGFP), denominated as HDAd/EGFP, performed large scale preparation and purification, and then identified the purified HDAd/EGFP under fluorescent microscope and electron microscope.After the concentration of HDAd/EGFP was determined by spectrophotometer, the transgenic expression efficiency of HDAd/EGFP was compared with first generation adenoviral vector encoding EGFP(FGAd/EGFP)in vitro.Therefore, we infected A549 cells with 2 000 virus particles(vp)per cell by HDAd/EGFP and FGAd/EGFP respectively and analyzed EGFP expressing level by flow cytometry.Consequently, the fluorescent expression rate and fluorescent intensity ofEGFP were higher in early infected A549 cells by HDAd/EGFP than by FGAd/EGFP.HDAd, capable of expressing transgene instantly and efficiently in vitro, is a potential vaccine vector.

Keywords:helper-dependent adenoviral vector(HDAd), first generation adenoviral vector(FGAd), enhanced green fluorescent protein(EGFP), transgenic expression

辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector，HDAd)是在第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector，FGAd)基础上研制的一种全缺失的腺病毒载体[1]，仅含有腺病毒复制信号(ITRs)和包装信号(Ψ)，需要辅助病毒为其提供包装所需的所有蛋白。与 FGAd相比，HDAd具有转基因容量大、转基因表达时间长、安全性高等优点，十多年来，HDAd主要用于基因治疗，作为疫苗载体的研究起步较晚，通过肌肉或静脉注射发现 HDAd具有更强的诱导机体产生针对转基因的免疫反应[2-4]，我们通过滴鼻途径免疫动物也获得了类似的结果[5]。这种增强的免疫应答主要与HDAd可在体内高表达转基因及减弱的载体反应有关，关于这 2种载体体外转基因表达情况的研究较少。

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)为Shimomura等[6]于1962年从多管水母属Aequorea victoria中首次分离获得，1992年由Prasher等完成其 cDNA的克隆，其开放读码框(Open reading frame，ORF)编码 238个氨基酸[7]。GFP无种属特异性、可在不同种属细胞或组织中稳定发出荧光，荧光检测不需要外加底物和辅助因子[8-9]。利用荧光显微镜和流式细胞术(Flow cytometry，FCM)可直接观察[10]，无细胞毒性作用[8,11]，因此被广泛应用于基因表达与调控、基因转导、细胞分化及蛋白质的胞内定位和功能研究等方面，成为继LacZ、CAT后国内外分子生物学和细胞生物学领域广泛应用的报告基因。增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)是经过密码子优化及氨基酸突变等一些列基因改造后获得的 GFP突变体[12]，这种突变体不仅保留了GFP的所有优点，且更易于在真核细胞中表达，蛋白表达量增加，使EGFP表达的荧光强度比GFP高100倍以上，大大提高了检测灵敏度[13]，而且因其具有 B细胞、Th细胞和CTL细胞表位[14-15]，成为一种应用非常广泛的示踪蛋白和模式蛋白。

因此，本文以 EGFP作为报告基因，构建可表达EGFP的 HDAd/EGFP载体，大量扩增纯化及表达鉴定，并与FGAd/EGFP一起开展转基因体外表达效率的比较研究，以期为HDAd作为疫苗载体的研究提供更全面的基础信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和毒株

HDAd Cre/loxP系统及 293Cre4细胞和辅助病毒H14购自加拿大Microbix公司，A549细胞由中国科学技术大学生命科学院魏海明教授馈赠，293细胞、CsCl超速离心纯化的可表达EGFP的复制缺陷型重组腺病毒FGAd/EGFP由本室保存。

1.1.2 菌株和质粒

E.coliDH10B菌株由本实验室保存，pSC11、pSC15B由美国梅奥医院血液肿瘤科石长信博士构建[16]。

1.1.3 主要试剂

限制性内切酶PmeⅠ、I-SceⅠ、I-CeuⅠ购自美国New England Biolabs公司，SAP酶、DL 1 kb marker购自Fermentas公司，T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pfu酶购自上海 Promega公司，DL2000 marker、ExTaqDNA聚合酶、其他限制性内切酶是TaKaRa公司的产品，质粒提取及纯化试剂盒、PCR产物回收及纯化试剂盒购自美国Omega公司，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR获得CMV-EGFP-SV40片段

用 FGAd/EGFP按 500 vp/细胞感染丰度约为90℅的293细胞，待72 h后，收集细胞采用Hirt法快速提取腺病毒 DNA，以此为模板，用 PCR法扩增获得目的片段 CMV-EGFP-SV40。上、下游引物分别为：5′-GTCGACTAGTAATCAATTACGGGG-3′和 5′-ACGCGTTAAGATACATTGATGAG-3′，并在引物5′端分别引入SalⅠ和MluⅠ的酶切位点。PCR条件：95℃预变性 5 min；94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃最终延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

将 CMV-EGFP-SV40的 PCR回收产物与pGEM-T连接、转化、挑菌、摇菌和小提质粒，获得质粒命名为pGEM-T/EGFP，进行测序。测序鉴定正确后用SalⅠ和MluⅠ酶切pGEM-T/EGFP，切胶回收纯化CMV-EGFP-SV40片段，置于−20℃保存备用。

1.2.2 重组腺病毒质粒pSC15B/EGFP的构建

用SalⅠ和MluⅠ双酶切pSC11，将CMV-EGFPSV40与pSC11连接、转化、挑菌、摇菌，然后小提质粒，用SalⅠ和MluⅠ酶切鉴定。获得的重组质粒命名为pSC11/EGFP。

用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP，T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶进行末端补平及连接，去除PmeⅠ酶切位点，获得重组质粒命名为 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ。

用 I-SceⅠ和 I-CeuⅠ双 酶 切 pSC11/EGFPNheⅠ-PmeⅠ和pSC15B，进行连接、转化、挑菌和摇菌。提取质粒用Hind Ⅲ酶切鉴定，同时以Hind Ⅲ酶切 pSC15B作对照。得到连接成功的质粒进一步用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鉴定，获得的重组质粒命名为pSC15B/EGFP[17]。

1.2.3 重组腺病毒HDAd/EGFP的获得

用60 mm×15 mm培养皿培养293Cre4细胞待丰度达到90%左右时，取PmeⅠ酶切消化的pSC15B/EGFP线性化片段经磷酸钙共沉淀法转染。转染后第2天，弃掉培养液，加入含2% FBS的DMEM维持液。取辅助病毒H14，按500 vp/细胞感染293Cre4细胞，置 37℃、5% CO2培养箱中继续培养。约48～72 h后，细胞完全病变、脱落，收集脱落后的细胞及上清，转移至15 mL离心管中，2 000 r/min离心5 min。弃部分上清，保留约4 mL，用吸管重悬沉淀，−80℃冰箱冻存30 min，37℃水浴融化，反复3次，获得P0代HDAd/EGFP粗体液，取1 mL接种至形成单层、含2% FBS的DMEM维持液的293Cre4细胞中，同时按 100 vp/细胞加入辅助病毒，37℃、5%CO2培养箱继续培养至细胞病变。约48 h后，细胞完全病变、脱落，按上法处理293Cre4细胞，重复6轮获得P6代HDAd/EGFP粗提液[17]。

1.2.4 重组腺病毒HDAd/EGFP的大量制备及纯化

用30个150 mm×25 mm培养皿培养293Cre4细胞，待细胞丰度约为90%时，取HDAd/EGFP和辅助病毒H14共感染293Cre4细胞，约48～72 h后，收集细胞及培养液。采用 CsCl密度梯度和连续密度梯度法 2次超速离心纯化HDAd/EGFP，样品在4℃、10 mmol/L Tris-HCl 8.0中透析24 h，期间换液 3次[17]。电镜下观察纯化后病毒形态并保存于−80℃备用。

1.2.5 转基因EGFP的表达鉴定

用100 mm×20 mm培养皿培养293Cre4细胞，待细胞丰度约为90%时，用纯化的HDAd/EGFP感染293Cre4细胞，荧光显微镜下观察。

1.2.6 分光光度计测定纯化重组腺病毒HDAd/EGFP的病毒颗粒浓度

用含0.1℅ SDS的TE溶液稀释纯化的HDAd/EGFP，同时设置阴性对照。56℃温育 10 min，涡旋振荡样品后使用分光光度计测OD260的值。根据公式计算纯化重组腺病毒HDAd/EGFP的病毒颗粒浓度[18]：

病毒颗粒浓度(vp/mL)=(OD260值×稀释倍数×1.1×1012×36)/HDAd/EGFP 碱基数(kb)

1.2.7 重组腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP转基因EGFP表达的比较

用 2块 24孔板培养A549细胞，待丰度达到90%左右时，分别用2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞，同时以培养的正常A549细胞作为阴性对照。

在感染后1、3、8 d时分别随机取HDAd/EGFP或FGAd/EGFP感染的A549细胞各3孔，弃培养液，用PBS液洗涤2遍后用0.25%胰酶消化，镜下观察待呈单个贴壁细胞时，弃胰酶，用PBS液吹打成单细胞悬液，流式细胞仪检测每10 000个A549细胞的EGFP表达率和EGFP平均荧光强度。

1.2.8 统计学分析方法

采用 SPSS11.5统计学软件对重组腺病毒HDAd/EGFP和FGAd/EGFP转基因EGFP表达率和表达强度进行统计学分析，两组比较使用单因素多组方差分析，当方差不齐时使用t检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 PCR获得EGFP表达盒

以 FGAd/EGFP为模板，用 PCR法扩增获得EGFP表达盒CMV-EGFP-SV40片段，1℅琼脂糖凝胶电泳，观察到介于1 000～2 000 bp的DNA片段，与预期值 1 627 bp相符(图1)。回收的 CMVEGFP-SV40片段与pGEM-T连接，测序正确。

图1 PCR产物琼脂糖电泳结果Fig.1 PCR product of CMV-EGFP-SV40.1: DL2 000 marker;2: PCR product of CMV-EGFP-SV40.

2.2 构建 HDAd/EGFP重组质粒 pSC15B/EGFP及酶切鉴定

将CMV-EGFP-SV40克隆至载体pSC11，SalⅠ和MluⅠ酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示得到2条带，约为3 000 bp和1 600 bp，与pSC11、CMVEGFP-SV40大小一致(图2)。为进一步将EGFP表达盒克隆至pSC15B，需去除pSC11/EGFP中的PmeⅠ酶切位点，用NheⅠ和PmeⅠ酶切pSC11/EGFP，末端补平、连接后用PmeⅠ和XbaⅠ进行酶切鉴定，可观察到5 000 bp左右的线性化条带，证实已去除了PmeⅠ酶切位点。

进一步克隆EGFP基因至pSC15B，大提质粒并用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、Hind Ⅲ、PstⅠ酶切鉴定，与预计结果一致(图3)。

2.3 超速离心纯化后病毒带的观察

HDAd/EGFP与辅助病毒 H14共感染 293Cre4细胞进行扩增，经CsCl密度梯度和连续密度梯度超速离心纯化后，在管的中下部可见到上下2条乳白色病毒带，上面的带即为纯化后的HDAd/EGFP(图4)。

2.4 电镜鉴定重组腺病毒HDAd/EGFP形态

纯化后的 HDAd/EGFP经磷酸钨负染，在透射电镜下可见腺病毒典型的二十面体结构，直径约为70 nm，病毒结构完整(图5)。

图2 酶切鉴定pSC11/EGFPFig.2 pSC11/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1: DL2 000 marker; 2: pSC11/EGFP digested withSalⅠandMluⅠ.

图3 酶切鉴定pSC15B/EGFPFig.3 pSC15B/EGFP identified by restriction endonuclease assay.1:PstⅠ; 2:EcoRⅤ; 3:EcoRⅠ; 4:BamHⅠ; 5:HindⅢ;M: DL1kb marker.

图4 经CsCl超速离心后HDAd/EGFP病毒条带Fig.4 HDAd/EGFP purified by CsCl ultracentrifugation.

图5 纯化的 HDAd/EGFP电镜下形态(1%磷钨酸pH 6.8负染，TECNAI-12)Fig.5 Purified HDAd/EGFP under electron microscope(TECNAI-12).

2.5 荧光显微镜观察转基因EGFP的表达

将纯化后的 HDAd/EGFP感染 293Cre4细胞，荧光显微镜下观察可见明显的绿色荧光(图6)。

2.6 重组腺病毒HDAd/EGFP浓度计算

图6 HDAd/EGFP感染 293Cre4细胞后表达的 EGFP(Nikon TE2000-S，100×)Fig.6 EGFP expressed by HDAd/EGFP infected 293Cre4 cells(Nikon TE2000-S, 100×).

纯化后的HDAd/EGFP稀释10倍后测得OD260值为0.33，HDAd/EGFP碱基数为33.089 kb，可得HDAd/EGFP 的病毒颗粒浓度为：(0.33×10×1.1×1012×36)/33.089≈4.0×1012vp/mL。

2.7 流式细胞仪检测HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞后EGFP的表达

以2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞后用流式细胞仪检测A549细胞的荧光表达率和表达强度。

图7 A549细胞感染后1天时的流式直方图Fig.7 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 1 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549 cells.

图8 A549细胞感染后3天时的直方细胞图Fig.8 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 3 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

图9 A549细胞感染后8天时的直方细胞图Fig.9 Flowcytometric histograms of infected A549 cells on day 8 after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).(A)A549 cells.(B)FGAd/EGFP infected A549 cells.(C)HDAd/EGFP infected A549.

图10 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549细胞后EGFP的表达率分析Fig.10 Percentage of EGFP expressed A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

图11 HDAd/EGFP、FGAd/EGFP感染 A549细胞后EGFP的荧光强度Fig.11 Fluorescence intensity of EGFP expressed by A549 cells after HDAd/EGFP or FGAd/EGFP infection(BECKMAN COULTER XL).

图7、图8、图9分别显示A549细胞感染重组腺病毒后 1、3、8 d时流式细胞仪所检测得到的流式直方图。图7A、图8A、图9A为A549细胞作为阴性对照，设置M1区域，图7B/C、图8B/C、图9B/C中M2区代表有EGFP表达的A549细胞。图10显示感染 HDAd/EGFP的 A549细胞在感染后的第 1天和第3天较FGAd/EGFP有更高的EGFP表达率(P＜0.05)，在第8天两者没有明显差异(P＞0.05)；图11显示感染HDAd/EGFP的A549细胞在感染后第 1天和第 3天，EGFP的平均荧光强度均比FGAd/EGFP强(P＜0.05)，在第 8天两者的平均荧光强度没有明显差异(P＞0.05)。

3 讨论

腺病毒为长约36 kb的线性双链DNA病毒，无包膜，具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、外源基因容纳量大、转导效率高、病毒滴度高、易繁殖和纯化等优点[19]，被广泛应用于基因治疗和疫苗研究中。FGAd由于保留了腺病毒的大部分基因，低水平表达的腺病毒蛋白不仅对转导的细胞产生毒性作用，在体内也可引起针对腺病毒载体的免疫反应，当再次使用腺病毒载体时，容易被机体免疫系统快速清除而无法长期表达转基因[20]。HDAd又被称为空壳载体(Gutless or gutted vector)，缺失除了腺病毒复制信号(ITRs)和包装信号(Ψ)以外的其他所有腺病毒基因，感染后无病毒自身蛋白表达[1]，大大降低了细胞毒性和机体的免疫反应[20]，可以持续表达转基因达1年以上[21]，安全性更好；大量病毒自身基因的缺失使得HDAd的外源基因容纳量高达37 kb，可同时表达多个基因用于多基因疾病的研究[22]；另外，HDAd在包装过程中需要借助辅助病毒为其提供所有的结构和功能蛋白，来源于不同血清型的辅助病毒，可形成不同血清型的腺病毒，避免反复使用同一血清型腺病毒载体所产生的中和抗体的影响[23]。

本实验对HDAd和FGAd体外感染转基因表达率和表达强度进行了比较，我们分别用约2 000 vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞，结果显示感染HDAd/EGFP的细胞3 d内EGFP的表达率高于FGAd/EGFP感染的细胞，随着时间的推移2组 EGFP的表达率无统计学差异，提示在体外感染肺泡来源的上皮细胞后，感染的早期HDAd较FGAd有更高的转基因表达率；同时我们监测了 HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞后EGFP的表达强度，结果同样显示在感染后3天内HDAd/EGFP较FGAd/EGFP有更高的EGFP表达，随着时间的推移 2组的表达率也无统计学差异，说明感染早期HDAd在体外感染的肺泡上皮来源的细胞中转基因的表达较 FGAd具有一定优势。我们的结果与文献报道的体内结果基本一致[2-3]。由于HDAd/EGFP和FGAd/EGFP均为5型腺病毒来源，具有相同的衣壳蛋白，HDAd/EGFP较FGAd/EGFP有更高的体外转基因表达效率的原因，目前仍不是十分清晰，我们推测：1)FGAd/EGFP除了含有EGFP表达盒外，还含有17个腺病毒蛋白的ORF[3]，虽然缺失了E1和E3区，仍存在的低水平表达会影响或干扰EGFP的表达，而 HDAd/EGFP仅有一个 EGFP表达盒，不存在任何腺病毒蛋白的干扰，因此转基因的表达更加迅速、高效；2)两种载体转基因表达效率趋向一致的时间长短，与细胞生长状况有关，细胞活性的下降直接影响了HDAd转基因的高效表达。我们认为HDAd载体这种转基因瞬时高表达的特性是其作为疫苗载体，获得比 FGAd载体更好的免疫原性的重要原因之一。需要指出的是转基因的表达水平由多种因素决定，不仅与载体有关，也与转基因本身的生物学性质如细胞毒性作用等有关，这些因素会对HDAd的转基因表达效率产生一定影响。

由于大多数病毒通过黏膜途径，尤其是呼吸道入侵机体，因此我们认为应及时开展HDAd作为黏膜免疫载体的可行性及效率研究，以期为开发RSV等经黏膜途径感染的病毒疫苗探索一条新的途径。鉴于这种认识，我们选择了具有较好的免疫原性、不抑制机体的免疫应答[3,15-16]、也没有细胞毒性的EGFP作为模式蛋白，用于探讨 HDAd作为黏膜疫苗载体的可行性，避免转基因对HDAd免疫效果不利的影响，以期真实反映HDAd作为黏膜疫苗载体的可行性。进一步的实验证实了我们的想法，经滴鼻途径免疫 BALB/c小鼠的比较研究表明：HDAd/EGFP能诱导产生更好的体液、细胞及黏膜免疫应答，具有Th1和Th2平衡的特点，HDAd/EGFP加强(Boost)免疫具有明显的免疫增强效果。证实了HDAd作为黏膜疫苗载体用于预防经呼吸道黏膜途径感染的RSV等病毒病原的疫苗研究是合理、可行的，将有助于克服目前RSV等疫苗研究中存在的安全性不足、免疫效果不理想等问题，作为安全有效的黏膜疫苗载体，HDAd具有较好的应用前景[5]。

总之，我们已成功构建了 HDAd/EGFP载体，获得可高效表达EGFP的HDAd/EGFP，并在体外开展了转基因表达效率的初步研究，与 FGAd载体相比，HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性，证实HDAd是很有潜力的疫苗载体。

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Journals.im.ac.cn

In vitro transgenic expression efficacy of a helper-dependent adenoviral vector encoding enhanced green fluorescent protein

Xianxian Zheng1,2, Jinsheng He1,2, Yuanhui Fu2, Shaohua Xu2, Can Xie1, Changxin Shi3,Mei Zhang1, Xiaobo Wang1,2, and Tao Hong2,4
1 Department of Immunology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2 College of Life Sciences & Bioengineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China 3 Division of Hematology-Oncology, Mayo Clinic, Scottsdale AZ 85259, USA 4 Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China

Received:February 21, 2010;Accepted:April 28, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30671965).

Corresponding author:Jinsheng He.Tel: +86-10-51684080; Fax: +86-10-51683887; E-mail: jshhe@bjtu.edu.cn国家自然科学基金(No.30671965)资助。