DM301型大孔吸附树脂分离纯化大黄总蒽醌的研究△

曹骋，叶殷殷，王浩龙，江滨

（广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

DM301型大孔吸附树脂分离纯化大黄总蒽醌的研究△

曹骋*，叶殷殷，王浩龙，江滨

（广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

目的：研究DM301大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能及分离纯化工艺参数。方法：以大黄总蒽醌含量为评价指标，采用紫外分光光度法测定大黄总蒽醌的含量。结果：DM301大孔树脂对大黄总蒽醌适宜的交换吸附条件为：以10g大孔吸附树脂为标准量，最大上样量为3.4g·g－1（生药材／干树脂），最佳上柱工艺为药液浓度含生药量0.40g·m L－1，pH6，流速为1mL·min－1，90%乙醇洗脱，洗脱液用量为80mL。验证实验证明，DM301对大黄总蒽醌的动态吸附率在70%以上，洗脱率在80%以上。结论：DM301大孔树脂交换吸附大黄总蒽醌的纯化方法可取，具有良好的应用前景。

DM301大孔吸树脂；大黄；总蒽醌；分离纯化

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根及根茎。其味苦、性寒，具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀痛经，利湿退黄的功能［1］，为临床常用中药之一。大黄的化学成分较复杂，其主要成分为蒽醌类衍生物，传统分离提取大黄总蒽醌有明胶沉淀法、醇沉调pH值法、聚酰胺法等。近年来，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面得到广泛运用，不断受到药学研究者的关注。金波等［2］以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及WLD型大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80%以上。许汉林等［3］比较了 D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型号的5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能，该研究认为D301树脂对大黄总蒽醌的吸附性能较好。DM301型树脂是一种中等极性的树脂，对分离黄酮类、生物碱、蒽醌类等成分有较为明显的效果，目前应用DM301型树脂纯化大黄总蒽醌的研究却尚未见报道。本文通过对提取液pH、提取液浓度、最大上样量、洗脱液浓度、洗脱流速、洗脱用量等方面的考察得到DM301树脂分离纯化大黄总蒽醌技术参数，从而为大黄中蒽醌类有效物质的提取和纯化提供参考。

1 仪器与材料

Spectronic GENESYSTM2紫外分光光度计（美国）；SHIMADZU CORPORATION AEG-220万分之一电子分析天平（日本岛津）；Sartorius BP211D十万分之一天平（瑞士）；PHB-4型pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

DM301树脂（天津市海光化工有限公司）；1，8-二羟基蒽醌对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号0829-9702）。所用试剂为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司），所用水为双蒸水。

大黄药材由广州致信中药饮片有限公司提供，经广州中医药大学中药鉴定室黄海波副教授鉴定为四川产药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根茎。

2 方法

2.1 大黄提取液的制备

取过一号筛（10目）的大黄粉末适量，置具塞圆底烧瓶中，加入60%的乙醇溶液12倍量，于恒温水浴锅中加热回流提取3次，每次30min，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至无乙醇味，高速离心，3 000 r·min－1。取上清液，调节溶液质量浓度至0.40g·mL－1，作为母液，母液中总蒽醌含量为0.76mg·mL－1。

2.2 大黄总蒽醌的含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备 精密量取大黄提取液（或流出液）2mL，置具塞锥形瓶中，蒸干，加入2.5mol·L－1硫酸溶液10mL和三氯甲烷10mL，水浴加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液层用三氯甲烷提取至三氯甲烷层不显黄色，合并三氯甲烷液，三氯甲烷液继续用水洗至中性，减压回收溶剂至干，残渣加0.5%Mg（Ac）2甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加0.5%Mg（Ac）2甲醇至刻度，摇匀。精密移取上述溶液1.0mL，置10mL容量瓶中，加0.5%Mg（Ac）2甲醇至刻度作为供试品溶液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取P2O5干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌对照品适量，加乙醚制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.2.3 标准曲线的制备及线性范围考察 精密量取上述标准溶液0.20，0.60，1.00，2.00，3.00mL，分别置于10mL量瓶中，挥干三氯甲烷，残渣用0.5%Mg（Ac）2甲醇溶液溶解，加至刻度，摇匀。以0.5%Mg（Ac）2甲醇溶液为空白对照，于520nm波长处测定其吸光度，得回归方程：Y＝44.405X＋0.037 9，r＝0.999 8，线性范围2.10～31.4μg·mL－1。

2.2.4 颜色稳定性试验 取2.3项下3号试样，分别在0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h测定吸光度，其结果分别为0.511，0.511，0.510，0.509，0.507，0.502，0.496，表明显色在2h内较稳定，2h以后吸光度逐渐变小，故最佳测定时间范围为2h内。

2.2.5 精密度试验 取同一份供试品溶液，以0.5%Mg（Ac）2甲醇溶液作为空白对照，在520nm处连续测定吸光度6次，结果RSD＝0.2%，表明方法精密度良好。

2.3 大孔树脂预处理

DM301树脂为中等极性树脂，比表面≥330m2·g－1，平均孔径为14～17nm，适用于黄酮类、多酚类的分离，为新购干净树脂。预处理只需取树脂适量，乙醇浸泡24h，抽滤至干，上柱，继续用乙醇洗至流出液与水混匀不产生混浊，水洗至无醇味，即可。

2.4 大孔树脂吸附量、吸附率的计算方法

吸附量＝（母液浓度－滤液浓度）×溶液体积／干树脂量

吸附率 ＝（母液浓度 －滤液浓度）／母液浓度×100%

洗脱量＝洗脱液浓度×洗脱液体积／干树脂量

洗脱率＝洗脱量／吸附量×100%

2.5 交换吸附大黄总蒽醌

2.5.1 pH值对DM130树脂静态交换吸附大黄提取液的影响 分别称取吸干其表面水分的活化处理树脂各1.5g，精密称定，平行3份。分别置于50mL三角瓶中，各加入15mL大黄提取液，用2mol·L－1NaOH调节 pH为 6，7，8，9，放置24h，不时振摇，滤过，取提取液及滤液1mL，按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度，计算吸附量和吸附率（），结果见表1。

表1 pH值对DM130树脂静态交换吸附大黄提取液的影响

结果显示，pH对DM301树脂静态交换吸附容量，随着pH的增加而减少，当pH＝6时，DM301树脂对大黄提取液中总蒽醌吸附性能最好。

2.5.2 提取液浓度对DM301树脂交换吸附容量的影响 分别称取DM301树脂10g，上柱，分别加入含生药量为 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5g·mL－1的大黄提取液15mL，调节流速为1mL·min－1，分别收集流出液，定容至100mL。按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度，计算吸附量和吸附率），结果见表2。

表2 提取液浓度对DM301树脂交换吸附容量的影响

从表2结果可知，在大黄提取液含量较低时，DM301树脂交换吸附总蒽醌的能力随着提取液含量的提高而增加。当提取液含量为0.4g·mL－1时，其交换能力最好，为 25.4mg·g－1，其吸附率为73.69%。

2.5.3 最大上样量的确定 精密称取DM301树脂10g，上柱，加入含生药量为0.4g·mL－1的大黄提取液100mL进行交换吸附，调节流速为1mL·min－1，收集流出液，每5mL收集1次，共收集20份，编号，取1mL按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度。当流出液体积为85mL时，流出液中总蒽醌含量与之前相比没有明显减少，故认为每克干树脂最大吸附大黄药材量为3.4g。

2.5.4 不同乙醇含量对蒽醌类成分动态洗脱率的影响 取DM301树脂160g，加入含生药量0.4g·mL－1大黄提取液2 000mL进行交换吸附，放置24h，不时振摇，滤过，抽干水分。分别称取已交换吸附大黄提取液的大孔树脂各10g，上柱，平行3份。分别用水洗至洗脱液接近无色，分别用30%，45%，60%，75%，90%的乙醇各250mL进行洗脱，按1mL·min－1的流速进行洗脱，收集洗脱液，挥去乙醇，定容为100mL，按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度，计算洗脱量（），结果见表3。

表3 不同乙醇含量对蒽醌类成分动态洗脱率的影响

如表3所示，随着乙醇含量增加，洗脱大黄总蒽醌的能力提高，故认为90%乙醇洗脱大黄总蒽醌效果较好。

2.5.5 流速对洗脱能力的影响 取DM301树脂160g，加入含生药量0.4g·mL－1大黄提取液2 000mL进行交换吸附，放置24h，不时振摇，滤过，抽干水分。平行3份，上柱。用水洗至洗脱液接近无色，用90%乙醇150mL，分别调节流速为 0.5，0.75，1，1.25，1.5 mL·min－1进行洗脱，收集洗脱液，挥去乙醇，定容为50mL，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算洗脱量（），结果见表4。

表4 流速对洗脱能力的影响

如表4所示，当流速为1mL·min－1时，90%乙醇对大黄总蒽醌洗脱能力最高。

2.5.6 洗脱用量的确定 取DM301树脂10g上柱，平行3份。分别加入含生药量0.4g·mL－1大黄提取液15mL，待吸附后，用去离子水洗脱至流出液不呈黄色，用90%乙醇洗脱，收取洗脱液，每10mL收取一次，共收集13份，挥去乙醇，定容至10mL量瓶中，按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度。当收集到第8份时，洗脱液中总蒽醌含量已降至0.010 5mg·mL－1，故认为用90%乙醇洗脱剂80mL能将大黄总蒽醌基本洗脱下来。

2.6 验证实验

取DM301树脂10g，上柱，平行3份。分别加入0.4g·mL－1大黄提取液10mL进行动态交换吸附，水洗至洗脱液接近无色后，90%乙醇80mL，调节流速1mL·min－1进行洗脱，收取洗脱液，挥去乙醇后，定容成25mL，按2.2.1项下要求制备供试品溶液，测定吸光度，计算吸附率、解吸附率、RSD，结果见表5。

表5 验证实验

由表5结果可知，DM301树脂分离纯化大黄总蒽醌的工艺稳定可行。

3 讨论

大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，由于范德华力及氢键的作用而具有吸附性，还因具有网状结构和很高的比表面积而具有筛选性能。因此，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面具有重要的应用价值。但对于不同型号的大孔吸附树脂，其树脂本身的极性、孔径、比表面积、孔容以及上柱溶液的浓度、体积、pH值、化学成分的性质等均影响其分离、富集效果。同时，其解吸还受到洗脱剂的种类、浓度、体积、程序、流速的影响。

本研究考察了DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌类成分吸附纯化的工艺，从静态和动态两个方面进行考察，静态交换吸附主要考察了溶液pH对吸附能力的影响；动态交换吸附则从上样液的浓度、最大上样量，洗脱剂的含醇量、洗脱流速、洗脱液的用量进行考察，从而得到最佳的纯化工艺参数。

DM301树脂是苯乙烯型中极性共聚体，具有较大的孔径，适用于纯化有一定弱极性和极性的有机化合物。蒽醌类物质多含有酚羟基，可作为良好的氢键供体，有利于被极性树脂吸附。实验表明DM301型树脂对蒽醌类物质具有较强的富集能力。本实验研究初步确定DM301树脂对大黄总蒽醌纯化条件为：以10g大孔吸附树脂为标准量，最大上样量为3.4g·g－1（生药量／干树脂），最佳上柱工艺为药液浓度含生药量0.4g·mL－1，pH6，流速为 20d·min－1，90%乙醇解吸效果较好，洗脱用量为80mL。验证实验证明，DM301树脂对大黄总蒽醌的动态吸附率在70%以上，洗脱率在80%以上，纯化效果良好。DM301树脂纯化大黄总蒽醌工艺稳定，方法可取，具有良好的应用前景。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：22-23.

［2］金波，李薇，蔡伟.大黄总蒽醌提取与纯化工艺的研究［J］.时珍国医国药，2005，16（8）：756.

［3］许汉林，陈军，张赤志.不同型号大孔树脂对大黄总蒽醌吸附的研究［J］.湖北中医学院学报，2005，7（4）：20-22.

《药用植物栽培学》

《药用植物栽培学》由南京农业大学郭巧生教授主编，分总论、各论、附篇及配套光盘四大部分。总论部分共分9章，主要介绍药用植物栽培学的基本理论和方法等内容。各论部分按入药部位分为6章，从植物学形态、生长习性、繁殖方法、田间管理、病虫害防治、留种技术、产地加工及贮藏和运输等方面详尽地介绍了具有地区和用药代表性的36种常用药用植物规范化栽培技术。附篇补充收载了34种药用植物的规范化栽培技术内容。配套光盘除收载了全书内容外，还收录了国内外有关药用植物生产的法规和条例，以及大量与本书有关的彩色数码图片，供教学时选用。

本书主要作为农林和中医药高等院校中药、药用植物或相近专业的教材和教学参考书，同时亦可供有关中药材生产经营和中药资源开发利用及其他经济植物研究和生产的专业技术人员参考。

Study of the Purification of Total Anthraquinones in Rheum Officinale Baill.by DM301 Macroporous Resin

Cao Cheng，Ye Yinyin，Wang Haolong，Jiangbin
（1.Traditional Chinese Pharmaceutical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou Guangdong510006，China）

Objective：Study the property of adsorption and purification technology parameters of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.by DM301 macroporous resin.Methods：Using the content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.as the evaluation indicator，the content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.was determined by Ultraviolet spectrophotometry.Results：The content of total anthraquinones inRheum officinaleBaill.was the evaluation indicator and determined by Ultraviolet spectrophotometry.Results：The optimum adsorption condition is：the maximum sample volumes is3.4g·g－1（crude drug／drymacroporous resin）with the 10gmacroporous resin.，the concentration is0.4g crude drug permilliliter，pH6，flow rate 20d·min－1，eluted by 80mL and 90%alcohol，the verification experiment show that the adsorption rate reach more than 70%，the desoption rate reach more than 80%.Conclusion：The method of using DM301 macroporous resin to purificate total anthraquinones inRheum officinaleBaill.is effective，and it can be used more widely.

DM301 macroporous resin；Rheum officinaleBaill.；Total anthraquinones；Purification

国家科技支撑计划项目（2006BAI06A14-06）

*曹骋，E-mail：caosir＠126.com

2010-03-29）