夫台乌药不同生长年份块根中波尔定碱的分离与含量测定

王衍彬，童晓青，刘本同，于金慧，钱华

（浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

夫台乌药不同生长年份块根中波尔定碱的分离与含量测定

王衍彬，童晓青，刘本同，于金慧，钱华*

（浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

目的：测定不同年份和地点的天台乌药块根中所含波尔定碱含量。方法：应用高效液相色谱法测定，色谱柱：XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5μm）键合相填充柱；流动相：A相为乙腈，B相为1.5‰三乙胺（用甲醇调节pH至2.5），梯度洗脱，0～20 min，10%～20%A，90%～80%B。柱温25℃；流速1mL·min－1，检测波长289 nm。结果：波尔定碱含量以三州乡6年生为最高，达0.17%；5年生天台乌药块根波尔定碱含量高低次序为三州乡（0.16%）＞田芯乡（0.14%）＞永溪乡（0.10%）＞桐柏乡（0.06%）。结论：块根中波尔定碱的含量均与植物的生长发育年龄以及土壤条件有关。

天台乌药；波尔定碱；含量

乌药为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kosterm.的膨大块根，为传统常用中药，重要的理气止痛药，具有行气止痛、温肾散寒的功能。用于寒凝气滞，胸腹胀痛，气逆喘急，膀胱虚冷，遗尿尿频，疝气疼痛，经寒腹痛［1］。乌药主要含有挥发油、异喹啉生物碱及呋喃倍半萜及内酯等化学成分，其中生物碱类成分是乌药的主要活性成分，现代药理学研究表明其具有广泛的抗炎和抗关节损坏等药理活性［2］。20世纪90年代以来，关于乌药块根化学成分的分析，主要集中在挥发油以及倍半萜类成分［3-4］，近年来发现乌药块根含有多种异喹啉类生物碱，其含量、种类以及生物活性已有研究报道［5］。其中，有学者建议选择去甲异波尔定作为测定乌药质量的指标成分，也有选择波尔定、降波尔定、网状香荔枝碱和 Linderegatine作为指标成分［6-7］。有研究表明，异喹啉类生物碱中，波尔定碱抗氧化活性是异波尔丁碱的2倍，这表明异喹啉类生物碱的构效关系对其生物活性的影响至关重要［8-9］。鉴于此，本实验在乌药块根所含的4种异喹啉类生物碱中，选择波尔定碱作为含量测定的指标，采用高效液相色谱法对天台乌药块根在同一地点不同年份以及同一年份不同地点的波尔定碱含量进行测定，为天台乌药的质量控制提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters600高效液相色谱仪；2489型紫外可见检测器；XBridge C18色谱柱；BSA224s-cw赛多利斯分析天平，精度0.1 mg。

1.2 材料

2～6年生天台乌药块根分别采自浙江省天台县三州乡、田芯乡、永溪乡、桐柏乡，经浙江省林业科学研究院植物分类专家洪利兴研究员鉴定为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kosterm.的块根。洗净阴干后，置－25℃冰箱保存。块根的年龄采用徒手切片法制备样品横切薄片，置玻片上用倒置光源观察，根据纤维束环带的数目确定其年龄。波尔定碱对照品（Sigma，纯度为98%），甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国TEDIA公司），三乙胺（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），Millipore超纯水。

供试土壤于2009年5月采自浙江省天台县，选择了天台乌药产量较多的东、南、西、北4个样地的天然林地土样，分别为永溪乡（N 29°08′18.8″，E 121°10′58.2″），海拔 400 m；田芯乡（N 29°03′36.5″，E 120°42′46.3″），海拔 403 m；三州乡（N 29°12′59.7″，E 120°48′29.1″），海拔 274m；桐柏镇（N29°12′41.4″，E 121°00′31.8″），海拔 435 m。表层土壤样品的采样深度为10 cm，研究区内土壤类型主要以山地黄壤土为主，每个样地设3个重复。土壤采回后自然风干，然后粉碎，分别过20目和100目尼龙筛，供分析用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈为A相，1.5‰三乙胺（用醋酸调节pH至2.5）为B相，梯度洗脱，0～20 min，10%～20%A，90%～80%B。柱温：25℃；流速：1 mL·min－1，检测波长：289 nm，进样量：10μL［6-7］。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取波尔定碱对照品适量，加甲醇配成每1 mL中含波尔定碱0.985 mg的溶液，摇匀，即得。

2.3 线性关系考察

取波尔定碱对照品98.5 mg，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液转移至10mL容量瓶中，作倍比稀释，分别加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度为0.006 2，0.012 3，0.024 6，0.049 3，0.098 5mg·mL－1的对照品溶液。准确吸取上述对照品溶液10μL，按上述确定的色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算得回归方程为Y＝6X＋16.04，r＝0.999 4，说明波尔定碱进样量在0.06 2～0.98 5μg具有良好的线性关系。

2.4 供试品溶液的制备

准确称取同一地点（三州）采集的2～6年生天台乌药块根样品粉末0.1 g，精确到0.000 1 g，置100 mL具塞三角烧瓶中，加入甲醇10 mL，浸泡40 min，超声处理2次，每次20 min，超声频率40 Hz，功率120W。第一次超声后，放冷过滤，将滤渣再加10 mL甲醇后超声。合并2次滤液，减压回收溶剂，提取物浸膏用1 mL甲醇溶解后移入5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，0.45μm滤膜过滤即得。按上述同法制备从4个地点采集的5年生天台乌药块根样品的供试品溶液。

2.5 精密度试验

取4年生乌药样品1份，连续进样6次，按照峰面积计算RSD＝0.11%，表明仪器性能稳定。

2.6 稳定性试验

取4年生乌药样品1份，分别在0，4，8，16，24，48 h进行分析，测定波尔定碱，以峰面积计算RSD＝1.2%，表明供试样品溶液在48 h内是稳定的。

2.7 加样回收率试验

平行取6份4年生乌药样品，每份0.2 g，分别加入0.225 0 mg波尔定碱标准样品溶液，按照2.4的样品制备方法，制备供试样品溶液并测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 波尔定碱加样回收率

2.8 样品含量测定

分别精密吸取样品及对照品溶液各10μL，按照上述测定条件，分别测定同一地点不同年份以及同一年份不同地点的天台乌药样品，每个批次平行3份，每份样品平行进样2次，以外标法计算样品中波尔定碱的含量，结果见表2、3。样品和对照品HPLC图见图1。根据结果计算理论塔板数和分离度分别为880和1.38，基本达到分离效果。

表2 同一地点不同生长年份天台乌药块根中波尔定碱的含量测定

表3 同一年份不同地点的天台乌药块根中波尔定碱的含量测定

2.9 土壤主要营养成分分析

土壤全氮采用半微量凯氏定氮法，速效氮采用蒸馏法；土壤全磷采用高氯酸－硫酸酸溶－铝锑比色法，速效磷采用碳酸氢钠法；土壤全钾采用火焰光度法，速效钾采用1 mol·L－1NH4OAC浸提－火焰光度法。土壤pH值采用pH计测定；土壤有机质的测定采用重铬酸钾法。测试结果见表4。

表4 天台乌药不同样地土壤主要营养成分分析

图1 波尔定碱对照品及样品HPLC图

3 讨论

由于近年来野生天台乌药资源被大量采挖，目前已经很少能采集到6年生以上的乌药块根。根据本实验对当地所采集的乌药样品的分析统计，其中大部分为4～5年生，占85.7%，由于1年生的天台乌药还尚未形成块根，2年生以上的才形成块根，因此本实验只测定了2～6年生的乌药样品。如表2、图1所示，天台乌药块根中波尔定碱的含量与块根的生长发育年龄有关，从表2可以看出，其含量随生长年份的增大而增加。对波尔定碱的含量分析表明，天台乌药的最佳采收期应在6年以上。根据浙江省地方标准《地理标志产品——天台乌药》的规定，天台乌药的采集时间应为6～8年，可见是有一定依据的。

天台乌药波尔定碱的含量也与生长环境有关，尽管天台县全境内产的乌药都属于地理标志产品保护的范围，但来源于不同乡镇的天台乌药波尔定碱的含量确实存在一定的差异，从表3可以看出，5年生的天台乌药块根，其波尔定碱的含量以三州乡为最高，田芯乡其次，而三州乡的土壤N、P、K养分明显较其他乡镇为高。天台乌药在天台分布很广，基本上每个乡镇都有，特别是天台县的三州、平桥、街头、龙溪、石梁、华峰等地分布最为集中，产量也最大。而天台县不同区域之间乌药质量的相对比较值得探讨，这对指导今后发展天台乌药规模化人工栽培区域的合理布局具有积极的意义。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：71-72.

［2］王禅，戴岳，侴桂新，等.乌药总生物碱对大鼠佐剂关节炎的影响及其机制研究［J］.中国药理与临床，2006，22（3）：63.

［3］杜志谦，夏华玲，江海肖.乌药挥发油化学成分的GC／MS分析［J］.中草药，2003，34（4）：308.

［4］程显隆，魏锋，冯玉飞.RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量［J］.药物分析杂志，2003，23（3）：225.

［5］侴桂新，中村意夫，马超美，等.乌药中异喹啉类生物碱［J］.中国天然药物，2005，3（5）：272-275.

［6］陈建忠，侴桂新，杨莉，等.乌药中异喹啉生物碱去甲异波尔定的含量测定［J］.中国中药杂志，2009，34（21）：21-23.

［7］韩铮，苏慧丽，陈娜，等.高效液相色谱法同时测定乌药中的4种生物碱［J］.中国中药杂志，2009，34（5）：583.

［8］程轩轩，王冬梅，杨得坡.异喹啉类生物碱的生物活性和构效关系研究进展［J］.中草药，2006，37（12）：1900-1904.

［9］ Brien P.，Pozo C C.，Speisky H.Boldine and its antioxidantor health-promoting properties［J］.Chem Biol Interact，2006，159（1）：1-17.

Study on the Content of Boldine from Different Ages of Tiantai Linderae Radix Earthnut

Wang Yanbin，Tong Xiaoqin，Liu Bentong，Yu Jinhui，Qian Hua
（Zhejiang Academy of Forestry Sciences，Hangzhou Zhejiang310023，China）

Objective：To determine the contents of boldine from different ages and areas of Tiantai linderae radix earthnut.Methods：The HPLC method was established by XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm），using A phase of acetonitrile and B phase of 1.5‰ triethylamine（adjust pH to 2.5 with acetic acid）with gradient elution（0～20min，10% ～20%A，90%～80%B）as mobile phase，ata flow rate of1mL·min－1，a temperature of25℃and detected wavelength of 289 nm.Results：The highest content of boldine in Tiantai linderae radix earthnut which was 6 years old from Sanzhou was 0.17%，the contents of one in which was 5 years old was follow as：Sanzhou（0.16%）＞Tianxin（0.14%）＞Yongxi（0.10%）＞Tongbo（0.06%）.Conclusion：The results showed that the content of boldine was correlated with the age and area of Tiantai linderae radix earthnut.

Tiantai linderae radix earthnut；Boldine；Content

*钱华，E-mail：qianhua18＠126.com

2010-04-19）