奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定

王桢，罗军，王伟，赵旺生，林先滋

西北农林科技大学动物科技学院 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

组织工程与细胞培养

奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定

王桢，罗军，王伟，赵旺生，林先滋

西北农林科技大学动物科技学院 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

应用组织块培养法和高密度培养、连续传代法建立西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养体系，通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色 (角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白)、油红染色及β-酪蛋白基因的RT-PCR分析进行培养细胞鉴定。实验结果表明细胞生长曲线为典型的S型，染色体数目众数为60，细胞角蛋白、上皮膜抗原、波形蛋白、β-酪蛋白表达均呈阳性，油红染色后可见细胞质内的脂滴，且细胞表达酪蛋白 mRNA。说明运用本方法培养的细胞为正常的乳腺上皮细胞，并具有一定的泌乳功能。

奶山羊，乳腺上皮细胞，原代培养

Abstract:Based on thein vitroculturing system developed for epithelial cells in mammary gland of Xinong Saanen dairy goats using tissue explant culture, high density cultivation, and continuous passaging, the cultured epithelial cells were evaluated by growth curve fitting, karyotype analysis, immunofluorescence staining (keratin, epithelial membrane antigen (EMA), vimentin, β-casein), oil red staining and RT-PCR of β-casein gene. The results showed that the growth of epithelial cells with the model number of chromosome of 60 demonstrated a typical ‘S’ shape curve, the positive gene expression of keratin, EMA, vimentin and β-casein was detected, the cytoplasmic lipid droplets were observed following the oil red staining, the cultured cells expressed the mRNA of β-casein. In conclusion, the currentin vitroculturing system can obtain the normal mammary gland epithelial cells with the function of secretion.

Keywords:dairy goat, mammary gland epithelial cell, primary culture

乳腺是哺乳动物少数可以重复经历生长、功能分化和退化过程的器官之一。由于乳腺较强的分泌功能，可以使外源基因在乳腺中表达后随乳汁流出，乳腺上皮细胞成为转基因研究中重要的靶细胞。奶山羊是转基因动物研究的良好模型。根据羊奶与牛奶成分不同[1-2](如：羊奶短中链脂肪酸含量比牛奶高且脂肪球直径小)，推测山羊乳腺上皮细胞的乳成分合成及调控机制与牛不同，然而目前关于山羊泌乳的分子调控机制尚不清楚。乳腺上皮细胞的体外培养对于研究乳腺生长发育及阐明泌乳机制有重要意义，同时也为转基因研究中构建乳腺上皮细胞特异性表达载体提供有效模型。

本试验首次采用高密度培养、连续传代法对山羊乳腺上皮细胞进行体外培养，克服了常规培养过程中出现的难消化、潜伏期长等问题，获得了大量的乳腺上皮细胞，通过生长曲线绘制、核型分析、免疫荧光染色、酪蛋白检测、油红染色等鉴定了所培养细胞的生物学特性，为进一步在奶山羊乳腺上皮细胞中研究脂肪酸、乳糖代谢等网络调控机制及建立转基因打靶细胞模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1乳腺组织

以西北农林科技大学萨能羊原种场健康的纯种西农萨能羊 (泌乳天数为40 d) 为实验材料，手术法采集乳腺腺泡组织样品。

1.1.2主要试剂

DMEM/F-12、胰蛋白酶、表皮生长因子 (EGF)、Trizol购自美国Invitrogen公司；胎牛血清(FBS) 购自天津灏洋生物制品技术有限公司；胰岛素、氢化可的松、催乳素购自Sigma公司；角蛋白(Keratin) 抗体、波形蛋白(Vimentin) 抗体、上皮膜抗原 (EMA)抗体、β-酪蛋白(β-Casein) 抗体、SABC-Cy3免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他常规药品及试剂均为国产。

1.1.3主要仪器

CO2培养箱 (Thermo)；荧光相差显微镜(Leica)；冷冻离心机 (Thermo)；普通倒置显微镜 (国产) 等。

1.2 方法

1.2.1乳腺上皮细胞原代培养

采用组织块培养法，具体参见曹艳红等[3]的研究。

1.2.2乳腺上皮细胞的纯化及传代培养

利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞消化和贴壁的速率不同进行纯化，具体方法参考郑月茂等[4-5]的研究。经过4～6代即可得到纯化的乳腺上皮细胞。

纯化的乳腺上皮细胞的连续传代培养，具体方法：当 60 mm皿培养的细胞生长汇合至 95%左右(约 1.6×106～2.0×106个) 时，将培养基吸出，加入消化液，置培养箱内37℃消化3～5 min，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆、将要脱落时将消化液吸出，加入培养基，反复吹打使大部分细胞脱落，吸出 2/3左右的培养基 (约0.7×106～1.0×106个细胞)，离心后冻存 (90%血清，10% DMSO)。在原皿中补足新鲜培养基继续培养。第2天，细胞可生长汇合至95%左右，重复上述过程。

1.2.3细胞生长曲线

取第 20代乳腺上皮细胞以 3.2×104个细胞/孔的量接种于 24孔细胞培养板中，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每天同一时间对 3孔细胞分别计数，求平均值，连续9 d。以培养时间为横坐标，3孔细胞的平均数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.4染色体核型分析

待细胞 (20代) 生长汇合至50%时，秋水仙素处理6 h，消化为单细胞悬液，0.1 mol/L的KCl溶液低渗处理20 min，离心后用醋酸/甲醇 (1∶3) 固定，滴片后50℃烤片2 h，吉姆萨染液染色。

1.2.5免疫荧光染色

将细胞接种到24孔板中，分别进行角蛋白、波形蛋白、上皮膜抗原、β-酪蛋白免疫荧光染色，具体方法参照试剂盒说明书，操作完成后用Hoechst33342染核。一抗为单克隆鼠抗羊角蛋白抗体、单克隆鼠抗羊波形蛋白抗体、单克隆兔抗人上皮膜抗原抗体，单克隆兔抗羊 β-酪蛋白抗体，二抗为羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG。

1.2.6RT-PCR检测β-酪蛋白表达

Trizol法提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行 PCR扩增 (扩增长度 300 bp)。上游引物：5′-ACAGCCTCCCACAAAACATCC-3′；下游引物：5′-TGAGAAAGGGACAGCACGGA-3′。扩增条件如下：95 ℃ 4 min ；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72 ℃ 10 min。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7油红染色

在35 mm皿接种适量细胞，培养至第8天进行油红染色。方法如下：10%福尔马林预固定、40%福尔马林固定 1 h以上，用超纯水、60%异丙醇漂洗。干燥后加入1 ml 油红染液室温孵育15 min，超纯水洗数次，最后用Hoechst33342染核，在倒置荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 乳腺上皮细胞的原代培养和纯化

原代培养至第10天有大量乳腺上皮细胞迁出，胰酶消化，镜下可见细胞收缩变圆，与组织块分离(图1A)。经过3～5代的纯化培养，可以初步分离得到较纯的乳腺上皮细胞 (图1B)。有的可形成闭合型细胞群，呈岛屿状生长 (图 1C)。60代依然保持增殖活力及良好的细胞形态 (图 1D)。90代左右开始凋亡，镜下可见细胞由于细胞质融合而出现大量多核现象 (图 1E)。

图1 奶山羊乳腺上皮细胞形态观察Fig.1 Morphologiacal observation of the cultured mammary epithelial cells. (A) Mammary epithelial cells digested from the tissue fragment (50×). (B) Purified mammary epithelial cells (50×). (C) The island monolayer aggregate of mammary epithelial cells (50×).(D) 60th passage mammary epithelial cell (200×). (E) 90th passage mammary epithelial cell, the arrow indicates the multiple nucleuses in one cell (200×). (F) The fried-egg shape mammary epithelial cell in low density, as indicated by arrows (50×).

2.2 细胞生长曲线

以培养天数为横坐标，三孔细胞数的平均值为纵坐标绘制山羊乳腺上皮细胞生长曲线 (图 2)。结果显示：山羊乳腺上皮细胞生长延滞期0～3 d，对数生长期4～7 d，7 d后进入平台期，呈典型的S型，符合细胞生长的一般生物学规律。

2.3 染色体核型分析

对第20代的乳腺上皮细胞进行核型分析，大多数细胞染色体数目为60。其核型与山羊染色体图谱一致，说明所培养的细胞染色体未发生明显的变异(图 3)。

图2 奶山羊乳腺上皮细胞生长曲线Fig.2 Mammary gland epithelial cell growth curve of dairy goat.

图3 奶山羊乳腺上皮细胞染色体核型 (1 000×)Fig.3 Karyotype of mammary gland epithelial cell (1 000×).

2.4 免疫荧光染色

荧光显微镜观察结果显示：培养的乳腺上皮细胞角蛋白、上皮膜抗原、β-酪蛋白的表达均呈红色阳性，细胞核为蓝色；与国内多数报道不同，波形蛋白的表达亦呈阳性，且呈丝状均匀分布在细胞质内 (图 4)。

图4 乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定 (200×)Fig.4 Immunofluorescence of the mammary gland epithelial cell momolayer (200×). (A) Positive staining of Keratin, as shown in arrow. (B) Positive staining of EMA, as indicated in arrow. (C) Positive staining of Vimentin, the arrow indicates positive staining. (D) Positive staining of β-Casein, the arrow shows positive staining.

2.5 酪蛋白检测

电泳结果显示在300 bp处出现了目的条带，说明细胞表达了β-酪蛋白基因 (图5)。

2.6 油红染色

显微镜下可见大量大小不等的脂滴弥散于整个细胞质内 (图6A)；细胞生长密集的地方还可观察到乳球体，每个乳球体含较多脂滴，Hoechst33342染核后可见乳球体由大量细胞聚集而成 (图6B)。

图5 β-酪蛋白电泳检测Fig.5 RT-PCR analysis of β-casein gene. A: DL2000 marker;B: PCR product of β-casein gene.

图6 乳腺上皮细胞油红染色 (200×)Fig.6 Oil red staining of the mammary gland epithelial cell(200×). (A) Monolayer stained with oil red, lipid droplet in cytoplasm is stained red. (B) Dome structure stained with oil red and Hoechst33324, lipid droplet is stained red, the nucleus is stained blue.

3 讨论

尽管一般来讲，细胞培养的 2个连续代次之间应间隔至少2 d，使细胞在被胰酶损伤后得到充分的恢复[6]。但体外培养的乳腺上皮细胞贴壁非常牢固，且随着传代间隔时间的延长，所需消化时间越长。长时间的消化不仅会对细胞产生损伤，而且使终止消化的时机难以掌握。另一方面，据笔者观察，传代的乳腺上皮细胞在低密度培养时常体积变大，呈煎蛋形 (图1F)，而以高密度培养时细胞保持铺路石状，形态变化明显得到改善，且在200倍镜下可见细胞之间形成的连接 (图 4)，这与国外的相关报道一致[7-8]。有报道高密度培养对原代软骨细胞去分化有抑制作用[9]，然而在乳腺上皮细胞上的相关研究还未见报道。笔者用这种方法培养的乳腺上皮细胞不仅形态整齐良好，而且具有很强的增殖活力，与低密度培养、3～5 d传代一次的乳腺上皮细胞 (20代左右凋亡，历时约 80 d) 相比，这些细胞可在体外连续培养120 d左右 (60代以前可每天传代，60代以后随着细胞走向衰老传代间隔时间相应延长)。

角蛋白是上皮细胞的标志，波形蛋白是成纤维细胞的标志[10]。正常的乳腺上皮细胞同时表达角蛋白和波形蛋白的报道十分少见。国外 Mark等[11]用添加霍乱毒素、表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松等的培养液培养乳腺上皮细胞，36%的细胞同时表达波形蛋白和角蛋白。Dairkee等[12]则发现，在乳腺上皮细胞培养早期 (第4天)，所有的乳腺上皮细胞同时表达波形蛋白和角蛋白。这些报道限于培养的乳腺上皮细胞中的某一小部分或某一时期。在本实验中，所有乳腺上皮细胞可长期表达角蛋白和波形蛋白。从形态来看，细胞呈典型的铺路石状，与成纤维细胞明显不同；从免疫组化的结果来看，细胞表达上皮细胞特有的角蛋白、上皮膜抗原；此外，细胞合成酪蛋白，可形成乳球体，且油红染色可见细胞内脂滴，说明细胞有一定的泌乳特性，这些都是成纤维细胞所不具有的。因此认为高密度培养、连续传代法适用于山羊乳腺上皮细胞的培养。采用这种培养方法可以获得足够数量的、增殖活力良好的种子细胞，为进一步研究泌乳机制和建立转基因打靶细胞模型提供参考。

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Characterization and culture of isolated primary dairy goat mammary gland epithelial cells

Zhen Wang, Jun Luo, Wei Wang, Wangsheng Zhao, and Xianzi Lin

College of Animal Science and Technology,Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Northwest A&F University,Yangling712100,China

Received:January 13, 2010;Accepted:April 12, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2008AA10z135), Key Special Project for Breeding and Cultivation of GMO Varieties (No. 2009ZX08009-162B), R&D Special Fund for Public Welfare Industry (Agriculture) (No. 3-45).

Corresponding author:Jun Luo. Tel: +86-29-87082891; E-mail: luojun1@yahoo.com

国家高技术研究发展计划 (863计划) (No. 2008AA10z135)，转基因生物新品种培育重大专项 (No. 2009ZX08009-162B)，公益性行业 (农业) 科研专项经费项目 (No. 3-45) 资助。