青春牡丹多糖对自由基清除作用的研究

2010-10-09朱月，包楠

赤峰学院学报·自然科学版 2010年2期

关键词：光吸收超氧苯三酚

朱月，包楠

（赤峰学院生命科学系，内蒙古赤峰 024000）

青春牡丹多糖对自由基清除作用的研究

朱月，包楠

（赤峰学院生命科学系，内蒙古赤峰 024000）

采用邻二氮菲-Fe氧化法测定了青春牡丹多糖清除羟自由基（·OH）的作用，应用邻苯三酚自氧化反应体系产生超氧阴离子自由基（O2-）的方法测定青春牡丹多糖对超氧阴离子自由基的清除作用.结果表明，青春牡丹多糖具有清除羟自由基的作用，且呈明显的量效关系；对超氧阴离子自由基也具有清除作用.该结果提示青春牡丹多糖具有抗氧化作用.

青春牡丹多糖；羟自由基；超氧阴离子自由基；抗氧化作用

青春牡丹（Paeonia rockii‘Qing Chun’）是芍药科芍药属牡丹组紫斑牡丹品种群中的一个品种的变种.

紫斑牡丹是我国特有植物，为落叶灌木，是珍贵的花卉种质资源.牡丹自古以来皆用根皮入药.根皮中以牡丹酚为主要的药用成份，具有抗菌、降血压、清热凉血、活血化瘀的功能[1].关于牡丹多糖对自由基清除作用的研究却很少见报道.

本文以青春牡丹叶片多糖为试验材料，通过邻二氮菲-Fe氧化法、邻苯三酚自氧化法分别测定青春牡丹多糖对羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-）的作用，以探讨青春牡丹多糖的抗氧化作用.为紫斑牡丹的进一步利用提供科学根据，提高紫斑牡丹的药用价值、经济价值和应用价值.

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

青春牡丹叶片干制粉末由内蒙古赤峰学院赵雪酶老师主持的“紫斑牡丹的引种驯化”课题组提供.

1.2 仪器与试剂

DZKW—4恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），分析天平（上海天平仪器厂），TD低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），UV-9100型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），Milli-Q超纯水纯化系统.

无水乙醇、三氯乙酸、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、邻二氮菲、邻苯三酚、FeSO4，H2O2，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，盐酸，三羟基甲基氨基甲烷，以上试剂均为国产分析纯试剂.超纯水从实验室Milli-Q超纯水纯化系统获得.

2 方法

2.1 多糖的提取和纯化[2-5]

称取100目过筛干燥的青春牡丹叶片粉末10g，加入80%乙醇80ml，于80℃恒温水浴浸提40min,4000r/min离心20min，收集上清液.将沉淀再浸提一次.合并两次上清液，再将上清液与10%三氯乙酸按12：1混匀，冷藏静置24小时，离心15min,弃蛋白质沉淀.将除掉蛋白质的上清液加入适量无水乙醇,使上清液含醇量达80%，再将上清液浓缩至10ml，得青春牡丹粗多糖溶液.

2.2 多糖含量的测定[6]

2.2.1 葡萄糖标准曲线的制备

配制质量浓度为0.04mg/ml的标准葡萄糖溶液,低温保存备用.

分别取0.04mg/ml的标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml于10ml的试管中，不足1.0ml的用去离子水补齐，向试管中分别加入苯酚溶液2.0mL和浓硫酸4.0mL混匀，静置5min,于60℃的水浴中保温30min,490nm处测吸光值，以吸光度A为纵坐标，葡萄糖浓度C（ug/mL）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，求出直线方程.

2.2.2 样品液的制备

取青春牡丹粗多糖溶液0.1ml置于100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，制成多糖样品液于低温处保存备用.

2.2.3 样品多糖含量的测定

取1ml青春牡丹多糖样品液于干燥的试管中，向试管中加入苯酚溶液2ml和浓硫酸4ml，静置5min,于60℃的水浴中30min.490nm处测吸光度，重复三次，将光吸收值的平均值代入直线方程，计算青春牡丹多糖的含量.

2.3 青春牡丹多糖对羟自由基的作用[7-9]

取干燥洁净的试管按表1加入各试剂，每加入一种试剂要立即摇匀，在样品对照管和加样管中分别加入浓度为0.1256mg/ml青春牡丹多糖样品液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml.使各样品管所含多糖的浓度分别 0，0.00628，0.01256，0.01884，0.2512，0.03410mg/ml.最后加超纯水使每试管的总体积为10ml.37℃水浴保温1小时,于536nm比色测定吸光度.计算羟自由基清除率.

羟自由基清除率（d）=[A536（加样）-A536（损伤）-A536（样品对照）]/[A536（未损伤）-A536（损伤）]×100%

表1 加样顺序表

2.4 青春牡丹多糖对超氧阴离子自由基的作用[10]

2.4.1 自氧化速率的测定

取两支试管按表2加入25℃预热的缓冲液,然后加入预热的邻苯三酚（空白管用0.01mol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在320nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化.

表2 加样顺序表

2.4.2 样品的活性测定

各试管试剂成分见表3.测定方法同2.4.1.所不同的是要对加入同体积不同浓度多糖溶液的样品空白管的光吸收值和样品管邻苯三酚自氧化速率分别进行测定.计算清除率.

表3 加样顺序表

清除率(I%)计算公式为:I%＝ [A1-(A3-A2) /A1]×100%

3 结果

以标准葡萄糖浓度为横坐标，以其对应的光吸收值为纵坐标作图，得直线方程Y＝0.0102x-0.0047,相关系数r＝0.9995.标准葡萄糖浓度在8.0–40.0ug/ml范围内葡萄糖的含量与吸光度呈良好的线性关系.依据直线方程，求得青春牡丹叶片多糖含量为10.1%.

在 2.3中青春牡丹多糖浓度在 0.05～0.25mg/ml时，对羟自由基的清除率为14.21%～98.48%（见图1）.

在 2.4中青春牡丹多糖浓度在 0.01～0.07mg/ml时，对超氧阴离子的清除率为4.9%～8.1%（见图2）.

4 讨论

在试验研究中由于提取的粗多糖溶液存在杂质，对光吸收值的测定产生一定的影响.因此，在两项光吸收值测定时设置样品空白管可去除杂质对吸光度的干扰，以提高测定结果的准确度.

在反应产生羟自由基（·OH）体系中，邻二氮菲与Fe2+反应生成Fe2+-邻二氮菲配合物，该配合物在A536nm有最大吸收.而当·OH氧化Fe2+-邻二氮菲成Fe3+-邻二氮菲时，就使A536nm最大吸收消失或减弱.当反应体系中存在羟自由基（·OH）清除剂时，此氧化过程受到抑制，A536nm则降低不明显，故可通过A536nm值比较抗氧化剂清除?OH的能力[13].

本试验在反应产生羟自由基（·OH）体系中加入一定浓度的青春牡丹多糖溶液后，通过光吸收值的测定和羟自由基清除率的计算发现：青春牡丹多糖对羟自由基有很好的清除作用.并且随着多糖浓度的增加，对羟自由基的清除作用增强，且呈明显的量效关系.

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，这些中间物在320nm波长处有强烈的光吸收，并且中间物的积累在初始的4min范围内与时间成线性关系.据此，在初始的时间范围内，中间物光吸收值的大小与时间也呈线性关系.若邻苯三酚自氧化体系中有抗氧化剂存在，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，光吸收值降低.

试验发现，当邻苯三酚自氧化体系中加入不同浓度的青春牡丹多糖溶液时，光吸收值降低，说明青春牡丹多糖能催化O2-与H+结合，从而减少体系中的超氧阴离子自由基.数据显示：青春牡丹多糖在一定的浓度范围内对超氧阴离子自由基有一定的清除能力.