一种新型温控系统在胰岛干细胞分离中的应用

胡亮，冯靖祎，吕颖莹

浙江大学医学院附属第一医院 医学工程科，浙江 杭州 310003

一种新型温控系统在胰岛干细胞分离中的应用

胡亮，冯靖祎，吕颖莹

浙江大学医学院附属第一医院 医学工程科，浙江 杭州 310003

基于半导体变温的温度控制系统应用于胰岛干细胞分离，探索胰岛干细胞分离过程温度精密控制对胰岛干细胞分离效果的影响。温度控制系统利用热电冷却器的快速调温功能，并利用单片机调节PID参数，从而实现对目标温度的调控。采用雄性Balb/c小鼠作为供体分离胰岛，比较不同的胰岛分离过程温度控制方式得到的胰岛的效果差异。本温度控制系统应用后，每只小鼠胰腺分离纯化后收获量为(109±32) IEQ，胰岛纯度为96.2%±1.9% 。

胰岛干细胞分离；PID控制；热电冷却器；温度控制

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课题/研究背景：受浙江省科技计划项目(2008F70028)资助。从供体的胰腺中获得纯度高、数量多、活力强的胰岛细胞是进行胰岛干细胞移植的先决条件。用于胰岛干细胞分离的复合胶原酶的活性和温度是密切相关的，因此胰岛及胰腺干细胞分离过程需要精确的温度控制。本课题主要研制了一种用于胰岛干细胞分离过程的温度控制系统。

应用要点：把胰腺的灌注与消化都集中在不锈钢消化罐内进行，在供体胰腺灌注阶段只要把系统的温度设定到4℃即可，灌注完毕只要把系统的温度设定到37℃即可，灌注与消化时间可按照实际需求来控制。

实验设计/论文构思：首先对系统的温度控制进行温度实际测量，测试系统的温度控制精度。采用不同的温度控制方法对实验小鼠的胰腺进行灌注与消化，并对实验小鼠胰腺分离结果进行对比。实验结果表明本系统温度控制精确，可以提高胰岛分离效果。

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种严重威胁人类健康的多发性代谢疾病，而且发病率逐步上升。胰腺器官移植虽然可以有效地控制血糖代谢，提高生活质量[1]，但胰腺移植因手术创伤大、外科并发症多，治疗风险较大，并非糖尿病治疗的最佳方法[2]；细胞替代治疗是根治胰岛素依赖的糖尿病的最终手段[3]，胰岛干细胞移植是实现患者血糖长期稳定的有效方法。目前胰岛干细胞移植作为治疗糖尿病的一种新方法,已经展现出极其广阔的临床应用前景及巨大的社会与经济效益[4,5]。

从供体的胰腺中获得纯度高、数量多、活力强的胰岛细胞是进行胰岛细胞移植的先决条件[6]。用于胰岛干细胞分离的复合胶原酶的活性和温度是密切相关的，胰岛及胰腺干细胞分离过程需要精确的温度控制。目前国内外胰岛移植细胞分离温度控制主要采用两种方法：一种方法是通过冰袋的冷却，在酶灌注时将温度维持在4℃，当进行酶消化时再用电热丝加热至37℃；另外一种方法是在水浴箱上实现4℃和37℃的控制，水浴温度控制下的胰岛分离示意图如图1[7]所示。用这两种方法来进行胰岛分离的温度控制效果都不很理想。用第一种方法进行温控时，由于电热丝的热惯性很大，经常发生温度过冲，温控精度不够，严重影响了胰岛细胞的分离数量和存活质量。第二种方法虽然可以比较好地实现温度控制的要求，但是水浴加热升温缓慢，升温速率不高。酶的消化有时间性，过长的加热过程会降低酶对胰腺的催化效果，而且水浴方法需要管路连接，在管路上会有热量散发，不能保证酶进入消化罐时的温度为37℃。

图 1 水浴温度控制下的胰岛分离示意图

1 半导体变温的基本原理与应用

1834年法国物理学家帕尔贴发现，当有外加的直流电流流过由两种不同材料组成的封闭回路时，并在串联的闭合回路中通以直流电流时，在其两端的结点将产生吸热或放热的现象，这一现象为帕尔贴效应[8]。帕尔贴效应示意图如图 2 所示。

接通电源后，冷端的热量被移到热端，导致冷端温度下降，热端温度上升。由于半导体变温元件体积小，不需要任何制冷剂，无需压缩机、蒸发器等庞大的机械装置。半导体变温技术在低温生物学、超导技术、低温外科学、低温电子、通讯技术、激光技术、红外技术，以及空间技术等领域具有广泛的应用[9,13]。

图 2 帕尔贴效应示意图

2 系统的温度控制电路

本系统的温度控制对象是胰岛及胰腺干细胞分离的消化罐，通过键盘输入消化罐工作温度设定值，高灵敏度的热敏电阻温度传感器所测量的温度信号，经CPU(STC12C5A60AD/S2)的A/D口进行A/D转换，处理器把所测得的温度值送LCD液晶屏显示，同时将其与键盘设定的温度值进行比较，将差值进行PID处理后通过PWM脉宽调制控制功率输出电路，实现对半导体制冷器的精确控制，从而构成了实时闭环温度控制系统。系统的温度控制电路结构框图如图3所示。

图 3 温度控制电路结构框图

3 系统温度控制策略

系统温度控制采用PID控制。PID控制器是一种比例、积分、微分并联负反馈控制器。本文采用软件脉宽调制技术，利用PID算法控制单片机输出占空比可变的PWM信号，实现了对温度的精确控制。

4 动物实验

我们通过对实验小鼠的胰腺灌注与消化过程的温度控制，对比传统水浴法温度控制与本系统温度控制的优越性。

4.1 材料与方法

雄性Balb/c小鼠(8～12周龄，购至上海实验动物研究所，中国）；胶原酶Ⅺ（Sigma公司）；Ficoll 400（Sigma-AlDrich公司）；HBSS（invitrogen公司）；电子温度表（Fluke公司，50Ⅱ）；Legend RT低温水平离心机（Sorvall LEGEND RT）；手术显微镜（江苏镇江中天光学仪器公司，LZL-6A）；体式显微镜（Leica S60）；DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)；半导体变温温度控制系统（自制）。

提取胰岛用鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.2mL/20mg体重），常规固定，消毒，小切口心前区开胸，破心放血处死。迅速“十字切口”开腹，暴露第一肝门，紧贴十二指肠乳头处胆总管下端结扎，胆囊管部位胆总管带线，同时在该部位30G针头顺行穿刺，针孔处带线结扎,1～2min内灌注2mL液体。

将两个分离的胰腺放置在含有6mL HBSS（或含有0.5mg/mL胶原酶Ⅺ）的同一根50mL离心管内，将装有胰腺和6mL HBSS（或含有0.5mg/mL胶原酶Ⅺ）的50mL离心管放入37℃水浴中静置消化，消化时间为12min，消化后将离心管迅速取出，用力振荡10～20s使胰腺呈泥沙状，加入4℃ 的0.1%BSA-HBSS振荡10～20s终止消化。动物手术一般控制在30min内完成。

表 1 不同的胰腺分离过程温度控制方式分离纯化后获得的胰岛数量和纯度

通过不同的分离过程温度控制策略分离纯化胰岛，对分离出的胰岛数量和活性进行统计。采用双硫腙特异染色法（DTZ）染色，显微镜下观察胰岛的纯度和得率，并通过吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色检查分离获得的胰岛活性，比较不同的分离过程温度控制策略分离纯化胰岛数量和活性。

温度控制方法A：胰腺的灌注在底部放满冰的不锈钢盘子里进行，时间为2 min；胰腺的消化在DK-8D型电热恒温水槽内进行，时间为12 min。

温度控制方法B：胰腺的灌注在我们自制的半导体变温温度控制系统的消化罐里进行，时间为2 min；胰腺的消化也在我们自制的半导体变温温度控制系统的消化罐里内进行，时间为12 min。

4.2 实验结果

采用水浴法来控制胰腺的灌注与消化过程的温度控制，在灌注时实验小鼠腔内的温度为(6±3)℃，消化的加温速率是12 min，恒温效果为(37±2.5)℃；采用我们自制的半导体变温温度控制系统，胰腺的灌注与消化全在系统的消化罐内进行，灌注时温度为(4±0.3)℃，消化的加温速率是6 min，恒温效果为(37±0.5)℃。表1是在其它条件相同的情况下不同的胰腺分离过程温度控制方式分离纯化后获得的胰岛数量和纯度。

由表1可以看出在系统投入运行后，胰岛干细胞的数量和质量都有明显的提高。可见对胰岛分离过程温度的精确控制可以提高胰岛分离的数量和活性。

[1] Mayes JT,Dennis VW, Hoogwerf BJ,et al.Pancreas transplantation in type 1 diabetes hope vs reality[J].Cleve Clin J Med,2000 (4):281-286.

[2] White,S.A.,Shaw,J.A.,Sutherland,D.E.Pancreas transplantation[J]. Lancet, 2009:373,1808-1817.

[3] Andersen, D. K., and Frey, C. F. The evolution of the surgical treatment of chronic pancreatitis[J].Ann Surg,2010:251,18-32.

[4] Couzin J.Diabetes.Islet transplants face test of time[J].Science, 2004,306(5693):34-37.

[5] Korsgren O, Nilsson B, Berme C, et al. Current status of clinical islet transplantation[J].Transplantation,2005,79(10):1289-1293.

[6] 夏邦顺,金敏.从胰腺移植到胰岛干细胞移植[J].医学与哲学, 2003,24(10):10-12.

[7] A.M.James Shapiro, Camillo Ricordi,Bernhard J.Horing, et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation[J].N Engl J Med,2006(9):1318-1330.

[8] 余建祖,高红霞,谢永奇.电子设备热设计及分析技术[M].北京:北京航空航天大学出版社,2008.

[9] 周永安,欧林林.半导体制冷冰箱的研究[J].真空与低温,2001, 7(4):229-232.

[10] 钟广学.半导体制冷器件及其应用[M].北京:科学出版社, 1991.

[11] 徐得胜.半导体制冷与应用技术[M].上海:上海交通大学出版社,1992.

[12] 龚定农,等.半导体致冷冷敷仪的研制与应用[J].制冷,1998(3): 53-58.

[13] 张建中,陈嵩,王凤跃.温差电制冷技术在红外和激光领域的应用[J].激光与红外,1998,28(3):186-192.

Application of the Temperature Control System to Islet Stem Cell Separation Based on the Varied Temperature of Semiconductor

HU Liang,FENG Jing-yi, LV Ying-ying
Medical Engineering Department,First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou Zhejiang 310003,China

TP273+.2；R329.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2010.11.005

1674-1633(2010)11-014-03

2010-08-13

2010-10-17

本文作者：胡亮，硕士，工程师，浙江省医学会生物医学工程分会青年委员。

冯靖祎，硕士，高级工程师，中华医学会生物医学工程分会委员、浙江省医学会生物医学工程分会候主任委员。

通讯作者邮箱：jingyi@mail.hz.zj.cn

Abstract:Temperature control system,based on the varied temperature of semiconductor and applied to islet stem cell separation, are utilized to explore the effect, which is caused by process of precise temperature control of islet stem cells, on the impact of islet stem cell separation. With the utilization of the fast tempering function of the thermoelectric cooler and the Single-chip Microcomputer adjusting PID parameters, temperature control systems are used to achieve the regulation of the target temperature. Male Balb/c mice were used as the donors to separate islet, and we could compare the different effects of diverse temperature control methods in the procedures of the islet separations. As a result of the application of the temperature control systems, pancreas were purified with a harvest of (109±32) IEQ and the islet purity of 96.2±1.9% of each mouse.

Key words:islet stem cell separation;PID control;thermoelectric cooler; temperature control