运用均匀设计方法优化蓖麻变应原提取工艺✳

张爱琳,王昌禄,陈志强,陈勉华

(1.天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;2.天津农学院食品科学系,天津 300384)

0 引 言

蓖麻中的变应原(Allergen)属于 CB-1A型,是由少量的碳水化合物(2%～ 3%)与蛋白质聚合而成的糖蛋白,属于脲类,为浅黄色晶体,溶于水,在沸水中稳定[1].变应原具有强烈的过敏活性,并具有抗原性.变应原的多糖增强了变应原的致敏性,1 ppm浓度的变应原水溶液对过敏患者有阳性皮肤反应[2],将它注入动物体内会产生抗体,其毒性对人只过敏不会致死,对动物危害重些但不会致死,对小白鼠注射 8.4μg/kg使小白鼠产生致命性过敏[3].蓖麻籽经过榨油后的残渣蓖麻饼粕含有 3%～4% 的蓖麻变应原,为了充分利用蓖麻变应原作为植物源杀虫剂代替有机杀虫剂,对蓖麻变应原提取工艺进行优化研究,从而找到了一种能够有效地解决蓖麻变应原制备的合适工艺.本文通过均匀优化设计,考察了影响蓖麻变应原提取率的因素,并对蓖麻变应原进行了纯化研究.

均匀设计是我国数学家方开泰等独创的将数论与多元统计相结合而建立起来的一种试验方法[4].这一成果已在我国许多行业中取得了重大成果[5].均匀设计最适合于多因素多水平试验,可使试验处理数目减小到最小程度,仅等于因素水平个数.运用均匀设计方法考察乙醇浓度、提取温度、提取时间、物料比,通过在国内日益普及的 MATLAB数学分析软件中[6]的逐步回归和多元二次多项式回归方法[7-9]对试验数据进行处理.

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓖麻饼粕购于内蒙通辽,用粉碎机粉碎至粉末状,用 30μm(40目)筛子筛选,待用.

1.2 试剂与设备

无水乙醇、醋酸铅、无水硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠均为国产分析纯;酪蛋白标准品、乙腈、甲醇为国产色谱纯.蛋白质标准溶液、双缩脲试剂现用现配.分光光度计为日本岛津 721型;离心机Avanti J-E美国 BECKMEN COULTER;Shim-pack Vp-ODSC18(150×4.6 mm)型高效液相色谱柱(日本岛津公司);Bruker Vector22傅利叶变换红外光谱仪 (Bruker Optics公司).

1.3 变应原提取工艺路线

蓖麻饼粕→蒸煮浸提→过滤→冷却→抽提→浓缩→加无水乙醇→离心→沉淀用热蒸馏水溶解→乙醇浓度达 25%→离心→上清液加 10% 乙醇乙酸铅→离心→上清液使乙醇浓度到 75%→冷却→离心取沉淀物→真空冷冻干燥.

1.4 变应原中蛋白质的检测方法

采用双缩脲法,540 nm处测定吸光值.

1.5 紫外分光光度法检测波长的确定

取上述已定容到 100 mL的乙醇萃取液,用紫外分光光度计测吸收光谱,在确定的最大波长处测光吸收值.

1.6 变应原纯度检测

SDS-PAGE电泳检测,标准蛋白购自昊柏生物科技有限公司.标准蛋白:14 400～ 97 400道尔顿.

1.7 高效液相测定

色谱柱:Shim-pack Vp-ODS C18(150×4.6 mm);流动相:甲醇∶乙腈∶水(1∶1∶3 V/V);流速:1 mL/min;检测波长:272 nm;柱温:室温;进样量:20μL.

1.8 红外光谱结构鉴定

采用 KBr压片法经过红外光谱仪获得谱图.

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度法检测波长的确定

由图1可知,变应原在 190～ 400 nm范围检测时,在 195 nm有最大吸收峰,峰面积为 3.64;但它不能作为高效液相色谱的检测波长,需要再缩小范围.由图2可以看出,在 272 nm时有一个较小的峰,吸收峰的面积为 1.21.变应原属于一种比较特殊的过敏性糖蛋白,其结构较为复杂,蓖麻变应原含量越高,在最大波长显示的吸光值越大;反之则越小.

图1 变应原紫外扫描分析图Fig.1 UV scanning graph of allergen

图2 变应原紫外扫描分析放大图Fig.2 UV scanning graph enlarged of allergen

2.2 均匀设计优化提取工艺

2.2.1 试验数据的回归分析及方程的建立

应用 MATLAB软件中的逐步回归分析可知,以四因素作回归方程可信度较高,而这四因素的回归方程中又以纯二次模型的拟合程度较佳,如表1所示.由表2结果回归获得如下方程

表1 均匀设计四因素水平表Tab.1 Level table of four factors in uniform design

由各变量影响显著性检验值 F的大小,排出各因素对结果影响强弱的顺序为:X4＞XX4＞X X 2＞X 2＞X 1＞X 3.各因素极大(极小)值为:X2max=0,X4min=0.672 069 3;约定回归系数显著性检验临界值:FIS=0.1;最终方程复相关系数:R=0.805 388 1;最终方程剩余标准差:S=4.392 698×10-2;最终方程显著性检验统计量:F=6.769 271.

表2 均匀设计实验表Tab.2 Results of uniform design

2.2.2 优化结果

将此优化后的提取方法定为 1,2,进行提取效果实验比较,结果如表3所示.

表3结果显示:最佳提取条件是 A13 B8 C7 D11,即乙醇浓度为 85%,提取时间为 8 h,提取温度为50℃,提取物料比为 1∶21.选用上述的提取条件得到的蓖麻变应原萃取液,经过真空冷冻干燥得到浅黄色粉末.

表3 提取结果Tab.3 Results of ex traction experiments

2.3 变应原的电泳检测

图3 变应原纯品电泳凝胶图Fig.3 Electrophoresis graph of allergen

经 SDS-PAGE电泳之后,在电泳带变应原提取物只出现一条区带,如图3所示.位置略低于鸡蛋清溶菌酶(14 400)的区带,表明所提取的变应原为纯品.

通过显色实验,提取物与茚三酮反应显深蓝色,molish反应产生紫红色环,与变应原的特征显色吻合.

2.4 高校液相色谱检测

由图4可知,主物质在 2.6 min左右出现单一峰,峰面积达到了 98%,且单峰有点脱尾.可见,提取物里的物质达到了较单一的成分.

2.5 红外光谱结构鉴定

由图 5可以看出,IR(KBr)cm-1:1 657.24,3 307.39(-CONH-);2 950.88(-CH2 or-CH3);1 077.61(-O-);3 307.39为典型的 -CO=NH-双键伸缩振动引起的吸收峰,可以鉴定提取物中主要成分为蓖麻变应原.

图4 蓖麻变应原粗品的高效液相谱图Fig.4 HPLC spectra of the allergen

图5 红外光谱图Fig.5 IR spectra of the allergen

3 结 论

在乙醇提取中,乙醇浓度、提取时间以及物料比均有显著影响.选用 85% 的乙醇提取效果好,浓度过高或过低都会影响提取液的极性,从而达不到最优提取的相似相容性;提取时间和物料比也是较显著的影响因子,提取时间过长或物料比过大,都会引起物力和人力资源的浪费;提取温度也不易过高,否则会引起乙醇的挥发,从而改变溶液的极性.因此,选择了最佳的乙醇提取条件,即在乙醇浓度为 85%,提取时间为 8 h,提取温度为 50℃,提取物料比为 1∶21(W/V)时,提取率达到了 0.38%.SDS-PAGE电泳得到一条较宽的条带,可以说明蓖麻变应原分离效果较好,达到了纯化的从红外谱图结果中可以看出提取物里含有典型的 -CO=NH-三键伸缩振动引起的吸收峰.因此,可以确定用该提取工艺提取出的物质为蓖麻变应原,经过高效液相分析谱图中监测出的物质含量达到 98%.

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